PEG化金纳米颗粒递送4-噻唑烷酮类内吞抑制剂Les-6623/Les-6632：合成、表征及对HIV-1 Tat与SARS-CoV-2刺突蛋白细胞摄取的抑制评价

《RSC Advances》：Nanoparticles improve targeting and efficacy of endocytosis inhibitorsOpen Access

内吞作用（endocytosis）是许多病毒（包括HIV-1（human immunodeficiency virus type 1）和SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2））用于进入宿主细胞的关键细胞过程。抑制该通路可提供有前景的抗病毒策略；然而，现有小分子抑制剂常受溶解度有限、脱靶效应和生物利用度差等因素限制。本研究报道了用新型内吞抑制剂Les-6623和Les-6632功能化的金纳米颗粒（AuNPs, gold nanoparticles）的合成与评价。这些化合物通过线性Knoevenagel缩合途径合成，并经核磁共振（NMR, nuclear magnetic resonance）和液相色谱-质谱联用（LC-MS, liquid chromatography–mass spectrometry）光谱确认结构。分子对接预测Les-6623和Les-6632与dynamin-2的相互作用比经典内吞抑制剂氯丙嗪（chlorpromazine）更有利。PEG化（PEGylation）金纳米颗粒用抑制剂功能化，得到通过紫外-可见光谱（UV–Vis, ultraviolet–visible）、荧光光谱、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR, attenuated total reflectance Fourier transform infrared）、动态光散射（DLS, dynamic light scattering）和透射电子显微镜（TEM, transmission electron microscopy）分析表征的制剂。在SH-SY5Y和BEAS-2B细胞中的功能实验显示，AuNP_Les-6623和AuNP_Les-6632在测试实验条件下降低与转铁蛋白（transferrin）、HIV-1 Tat和SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike protein）相关的细胞荧光。游离氯丙嗪作为参考抑制剂纳入。这些发现支持所研究纳米颗粒制剂在测试条件下的生物活性，同时需要进一步格式匹配对照以确定纳米颗粒呈现对观察活性的具体贡献。

本研究围绕内吞作用（endocytosis，细胞外物质经膜囊泡进入细胞的过程）这一病毒感染关键环节展开。HIV-1、SARS-CoV-2等可利用内吞进入宿主细胞，抑制该通路具有抗病毒潜力。现有小分子内吞抑制剂存在溶解度有限、脱靶效应和生物利用度差等问题；金纳米颗粒（AuNPs, gold nanoparticles）具有较高化学稳定性、易合成与功能化、相对低毒和良好生物相容性，PEG化（PEGylation，聚乙二醇化）可提高稳定性并延长循环。研究人员据此开发与内吞抑制剂Les-6623和Les-6632偶联的金纳米颗粒，并以转铁蛋白、HIV-1 CPP Tat和SARS-CoV-2 Spike蛋白为货物，在SH-SY5Y与BEAS-2B细胞中评价其降低细胞相关荧光的能力，氯丙嗪为参考抑制剂。研究结论支持所研究纳米颗粒制剂在测试条件下的生物活性，但定量载药、纳米颗粒呈现的贡献及具体内吞机制仍需进一步确定，为后续格式匹配对照和定量载药研究提供基础。

关键技术方法概括：合成采用线性Knoevenagel缩合，以¹H NMR、¹³C NMR与LC-MS确认结构；使用Schr?dinger Suite中SiteMap筛选dynamin-2结合口袋，并以Glide SP进行分子对接；MTT法在A172、U87、A549、Panc-1、SH-SY5Y及非恶性BEAS-2B细胞中评价细胞毒性；以AuNPs-PEG-COOH（10 nm，PEG 3000，Sigma-Aldrich）为载体，经pH滴定估算可及羧基后与质子化氨基静电结合；采用UV–Vis、荧光光谱、ATR-FTIR、DLS、TEM表征；在SH-SY5Y、BEAS-2B细胞（ATCC来源）中，用转铁蛋白-Alexa Fluor 647、Tat CPP-Cy5、SARS-CoV-2 Spike-Alexa 647，经共聚焦显微镜和荧光激活细胞分选（FACS, fluorescence-activated cell sorting）定量。

2.1 Synthesis of Les-6623 and Les-6632：通过线性Knoevenagel缩合合成4-噻唑烷酮类衍生物，收率70–90%，并经¹H NMR、¹³C NMR和LC-MS确认目标物；Les-6623与Les-6632的[M+H]⁺分别为m/z 323和389。

2.2 Molecular docking of interactions with dynamin-2：SiteMap预测dynamin-2表面5个潜在口袋，Site 2的Site Score为1.030、Drug Score为1.047，被选作对接口袋；对接分数Les-6623为?6.620 kcal mol^?1、Les-6632为?6.172 kcal mol^?1、氯丙嗪为?5.800 kcal mol^?1，两种Les化合物的配体效率也优于氯丙嗪，提示预测结合更有利。

2.3 Cytotoxicity of compounds Les-6623 and Les-6632：MTT法在A172、U87、A549、Panc-1、SH-SY5Y和BEAS-2B细胞中孵育48 h，Les-6623与Les-6632的IC₅₀均>100 μM，在所测细胞中无可见细胞毒性；氯丙嗪IC₅₀较低。

2.4 Functionalization and characterization of nanoparticles：PEG化金纳米颗粒与Les-6623、Les-6632通过质子化氨基与羧基的静电作用结合。2.4.1 Ultraviolet–visible (UV–Vis) absorption spectroscopy：PEG化AuNPs最大吸收523 nm，AuNPs_Les-6623为520 nm、AuNPs_Les-6632为521 nm，后者在384 nm有附加吸收。2.4.2 Fluorescence spectroscopy：PEG化AuNPs激发520 nm、发射582 nm；修饰后520 nm激发无荧光，纯化合物激发345/286 nm分别发射471/323 nm，修饰后仅在特定激发下出现弱信号，符合表面修饰。2.4.3 Attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR)：PEG层C–O 1111 cm^?1、C═O 1738 cm^?1、羧酸盐1636 cm^?1；修饰后1738 cm^?1消失、约1650 cm^?1增强、约3400 cm^?1出现NH⁺宽峰，支持离子缔合但不提供定量载药。2.4.4 Dynamic light scattering (DLS)：水动力直径9–42 nm，PEG化AuNPs zeta电位?8.306；加入Les-6623后先近零后稳定于?8.303，Les-6632后为?22.95；修饰后尺寸13–44 nm，48 h和8 d内未见明显变化。2.4.5 Transmission electron microscopy (TEM)：AuNPs核径8–12 nm，修饰后形态和尺寸相似，可见二至三个颗粒的小聚集体，但PEG层不能直接可视化。

2.5 Comparative analysis of transferrin endocytosis inhibition by AuNPs_Les-6623 and AuNPs_Les-6632：在SH-SY5Y细胞中以转铁蛋白-Alexa Fluor 647为货物，共聚焦和FACS均显示30 μM氯丙嗪降低荧光，但抑制低于部分报道，可能与含血清完全培养基有关；10 μM nominal纳米制剂较对应游离化合物进一步降低转铁蛋白相关荧光，Les-6623为19.23 ± 5.57%，Les-6632为34.51 ± 5.76%，统计差异支持纳米制剂在测试条件下降低更明显；未功能化AuNP-PEG对照未纳入，不能排除载体贡献。

2.6 Inhibition of Tat CPP endocytosis：在SH-SY5Y细胞中以Tat CPP-Cy5为货物，预处理1 h后加货物30 min；30 μM氯丙嗪使荧光降至对照61.53 ± 6.78%，AuNPs_Les-6623和AuNPs_Les-6632在10 μM nominal下分别降至17.68 ± 0.64%和19.88 ± 0.68%，低于氯丙嗪参考，统计显著性为****；未功能化AuNP-PEG对照未纳入。

2.7 Assessment of SARS-CoV-2 spike protein inhibition：在BEAS-2B细胞中以SARS-CoV-2 Spike-Alexa 647为货物，30 μM氯丙嗪使荧光降至对照59.14 ± 2.94%；AuNPs_Les-6623（5 μM nominal）和AuNPs_Les-6632（5 μM nominal）分别降至49.81 ± 2.24%和58.36 ± 2.49%，均较对照显著降低；未功能化AuNP-PEG对照未纳入，载体贡献不能排除。

2.8 Limitations of the study：研究局限包括纳米颗粒相关抑制剂的实际量未定量，所报道浓度为nominal；未评价无抑制剂PEG化AuNPs，载体本身贡献不能完全排除；与游离氯丙嗪比较非格式匹配，不能区分抑制剂结构与纳米颗粒呈现的贡献；摄取实验不能明确区分表面结合与完全内化，也不能区分内吞中间体与胞内递送；转铁蛋白和Tat可经多通路内化，不能确定dynamin依赖性；尚需生化确认dynamin抑制、通路特异性分析、血清稳定性、蛋白冠表征和体内评价。

讨论部分指出，dynamin本身是多效且背景依赖的靶点，参与内吞之外多种细胞过程，可能限制其抑制的特异性和转化应用。整体上，理化与生物学数据支持所研究纳米颗粒制剂在测试条件下的生物活性，但定量载药、纳米颗粒呈现的贡献及具体内吞机制仍待确立。

研究结论翻译：在本研究中，研究人员证明用Les-6623和Les-6632功能化的金纳米颗粒可降低所测荧光货物的摄取。在测试实验条件下，纳米颗粒制剂降低与转铁蛋白、HIV-1 CPP Tat和SARS-CoV-2 Spike蛋白相关的细胞荧光。游离氯丙嗪作为参考抑制剂纳入，并在制剂间观察到活性差异。然而，由于纳米颗粒相关抑制剂的量未定量测定，且与氯丙嗪的比较非格式匹配，当前数据不能确立纳米颗粒形式本身导致观察到的活性差异。这些发现为采用定量载药测定和格式匹配对照的进一步研究提供基础，以确定纳米颗粒呈现对这些抑制剂生物活性的贡献。