不同Brucella abortus抗原间接ELISA（iELISA）用于牛布鲁氏菌病诊断的开发与比较性能评价

《Veterinary and Animal Science》：DEVELOPMENT AND COMPARATIVE PERFORMANCE EVALUATION OF INDIRECT ELISA TESTS USING DIFFERENT B rucella abortus ANTIGENS FOR BOVINE BRUCELLOSIS DIAGNOSIS

• 验证采用不同Brucella abortus抗原的五种iELISA（间接酶联免疫吸附试验，indirect enzyme-linked immunosorbent assay）平台。• sLPS（平滑脂多糖，smooth lipopolysaccharide）和OPS（O-多糖，O-polysaccharide）-iELISA显示>99%的诊断敏感性（DSe，diagnostic sensitivity）和诊断特异性（DSp，diagnostic specificity）。• γ-辐照和BASA（Brucella abortus可溶性抗原，Brucella abortus soluble antigen）-iELISA达到约96%准确率，可作为可靠筛查工具。• 丙酮灭活抗原产生<80%准确率，限制其诊断适用性。• 鉴定高性能抗原以改进布鲁氏菌病控制规划。

研究背景与问题：布鲁氏菌病是由革兰阴性、非运动、非产芽孢、兼性胞内布鲁氏菌属（Brucella）细菌引起的人兽共患病，牛布鲁氏菌病主要由Brucella abortus造成，可导致妊娠末期流产、胎盘滞留、不孕以及阳性动物强制扑杀等经济损失。该病缺乏特异性临床症状，实验室诊断是监测、控制和根除计划的关键。病原分离培养被视为确认诊断金标准，但敏感性受样本类型限制、依赖活菌、需BSL-3实验室和受训人员；PCR等直接诊断虽可行，但准确性估计尚不充分且大规模实施困难。因此，控制与根除计划多采用血清学筛查与确认试验组合。玫瑰红试验（RBT，Rose Bengal test）和缓冲板凝集试验（BPAT，buffered plate agglutination test）等筛查试验敏感性高，后续需补体结合试验（CF，complement fixation test）、荧光偏振试验（FPA，fluorescence polarization test）、ELISA和2-巯基乙醇试验（2-ME，2-mercaptoethanol test）等确认。ELISA因可扩展性突出；iELISA在系统综述和Meta分析中显示最高DSe，但现有ELISA cutoff未标准化，主要商业iELISA价格高且抗原组成未知。因此，研究人员旨在开发并比较五种B. abortus抗原iELISA的DSe和DSp，并考虑疫苗抗原干扰及与小肠结肠炎耶尔森菌O:9（Yersinia enterocolitica O:9）抗体的交叉反应。
研究人员制备并比较五种抗原：B. abortus丙酮灭活、BASA、sLPS、OPS及γ-辐照B. abortus 2308；使用263份牛血清八组样本，以线性混合模型分析光密度（OD，optical density）连续变量并按概率密度估计DSe、DSp、cutoff及不确定区。结果显示sLPS和OPS-iELISA最佳，DSe/DSp>99%；γ-辐照和BASA约96%；丙酮灭活<80%。研究意义在于鉴定高性能抗原，为布鲁氏菌病控制计划提供候选诊断平台，并提示本地化生产可降低对进口商业试剂盒依赖。
关键技术方法：制备五种B. abortus抗原，包括B. abortus 544（ATCC 23448）的丙酮灭活抗原、BASA、sLPS、OPS，以及B. abortus 2308的γ-辐照灭活抗原；用Raman显微光谱进行抗原表征；使用263份牛血清，来源包括巴西Santa Catarina布鲁氏菌病暴发群、S19或RB51免疫小母牛、LFDA培养阳性自然感染牛、无病区牛及实验接种灭活Y. enterocolitica O:9的牛；优化iELISA微孔板、抗原浓度和血清稀释度，并以线性混合模型分析OD数据，估计DSe、DSp、cutoff和不确定区。
研究结果：1. 抗原Raman显微光谱表征：通过Raman显微光谱比较五种抗原，BASA波峰最多（n=16），其次OPS、sLPS和丙酮灭活抗原（n=4），γ-辐照抗原（n=3）；1370和1378 cm^-1处强度高；1378和1896 cm^-1处波峰提示所有抗原具有LPS特征谱；除BASA外，各抗原光谱相似。2. iELISA条件优化：通过优化确定各抗原适用微孔板、抗原浓度和血清稀释度，γ-辐照为1.0 μg/mL、1:100、Maxisorp；丙酮灭活为0.5 μg/mL、1:200、Maxisorp；BASA为1.5 μg/mL、1:200、Maxisorp；sLPS为1.5 μg/mL、1:400、Polysorp；OPS为1.0 μg/mL、1:400、Maxisorp。3. 不同抗原iELISA的OD反应：检测八组牛血清，sLPS和OPS-iELISA对阳性、阴性及交叉反应组的区分较清晰；γ-辐照和BASA次之；丙酮灭活抗原的阳性和阴性分布重叠明显。4. 诊断性能与不确定区：线性混合模型估计sLPS-iELISA DSe 99.57%、DSp 99.56%，cutoff 0.2698，不确定区0.2105–0.3488；OPS-iELISA DSe 99.25%、DSp 99.26%，cutoff 0.4234，不确定区0.3171–0.5666；γ-辐照DSe/DSp均96.91%，cutoff 0.8209，不确定区0.5460–1.2631；BASA DSe 96.45%、DSp 96.56%，cutoff 0.8921，不确定区0.5826–1.3867；丙酮灭活DSe 79.91%、DSp 79.77%，cutoff 0.2266，不确定区0.1070–0.5167。5. 概率密度分析：通过概率密度图区分阳性与阴性，sLPS和OPS不确定区较窄，γ-辐照和BASA次之，丙酮灭活正负分布大面积交叉。S19近期免疫组（G2、G3）未纳入准确性估计，仅用于观察检测行为，以避免疫苗诱导血清反应性偏倚DSp。
讨论总结：血清学检测是布鲁氏菌病控制与根除计划的主要工具，但常规试验难以区分自然感染、S19疫苗免疫和其他细菌感染诱导的抗体；大规模检测中DSp的小幅提升也可减少假阳性造成的不必要扑杀和项目成本。原文认为sLPS和OPS-iELISA性能最佳，感染诱导的多数抗体（>90%）针对OPS，二者高特异性与对Y. enterocolitica O:9抗体低交叉反应有关，也可能与排除近期S19免疫组有关；WOAH建议S19免疫犊牛在免疫后15个月后检测以降低假阳性，RB51具有区分感染与免疫（DIVA，differentiating infected from vaccinated animals）特性。sLPS/OPS-iELISA可用于地方流行区及根除计划，也可在不能实施系列诊断策略时作为单一试验。γ-辐照和BASA准确性稍低但可作为筛查试验，尤其BASA易于生产；其DSp可能受Y. enterocolitica O:9交叉反应影响，提示交叉反应至少部分针对LPS以外成分。丙酮灭活可能改变B. abortus表位化学结构，导致性能低，不适合诊断。Raman分析显示LPS是各抗原共同的反应成分，但不同抗原间DSe/DSp差异可能来自其他抗原成分；BASA谱峰最多可能与热灭活导致蛋白变性或新分子形成有关。原文提出“不确定区”可将OD位于cutoff附近的动物判为疑似，减少误诊，且不确定区越窄检测可靠性越高。研究还提示本地官方实验室生产iELISA可减少对进口商业试剂盒依赖，适合资源有限国家。局限性包括血清面板仅263份、流行病学背景有限，可能限制精度和外推性，并可能高估检测克服疫苗抗体和交叉反应的能力；未来需更大、独立、多场景样本及ROC曲线确定实用cutoff。研究结论翻译：采用sLPS和OPS抗原的iELISA获得约99%的DSe和DSp，是分类动物真实状态最佳者，在受评方法中显示最有前景的诊断性能。这些结果支持其作为单一血清学检测进一步开发和评价；但仍需使用更大且独立的样本面板确认诊断性能。γ-辐照和BASA-iELISA虽较不精确，但仍具有很好的区分布鲁氏菌病阳性与阴性动物的能力，支持其作为控制与根除计划筛查试验进一步研究。相反，丙酮灭活抗原iELISA性能差，表明该抗原不适合牛布鲁氏菌病诊断。