基于FRET竞争的功能导向OBOC筛选平台直接发现强效蛋白质–蛋白质相互作用抑制剂

《RSC Chemical Biology》：Function-based OBOC screening for the direct discovery of potent protein–protein interaction inhibitorsOpen Access

蛋白质–蛋白质相互作用（protein–protein interaction，PPI）是一类有吸引力的治疗靶点，但PPI抑制剂的发现仍具挑战性，因为PPI界面通常较浅且缺乏明确结合的 pocket。此外，仅靶标结合并不一定转化为功能抑制，化合物可与靶标蛋白结合而不破坏其与伙伴的相互作用，并在某些情况下甚至稳定复合物。诸如一珠一化合物（one-bead–one-compound，OBOC）筛选等组合库技术能够探索巨大的化学多样性，但由于传统OBOC筛选基于靶标结合而非生物功能选择命中物，因此易受非功能性或假阳性命中物影响。这些命中物包括结合于功能性PPI界面之外因而缺乏抑制活性的化合物、稳定而非破坏PPI的化合物，以及由亲合力、非特异性吸附或靶标蛋白被物理包埋于聚合物珠基质中产生的伪影。在此，研究人员报道一种功能型OBOC筛选平台，其将PPI破坏而非靶标结合确立为主要选择标准。通过将基于FRET（F?rster resonance energy transfer，荧光共振能量转移）的竞争分析整合到OBOC组合库中，仅当珠展示化合物竞争性且强效地将淬灭剂标记的结合伙伴从预组装靶标复合物中置换出来时，才选择该化合物，从而确保荧光阳性珠直接报告强效、功能性的PPI破坏。为验证该策略，研究人员将该平台应用于SRC-1/STAT6相互作用，通过筛选烃钉合肽OBOC库直接鉴定出高效功能抑制剂。使用DNA编码珠的概念验证实验进一步证实该选择策略与DNA编码库（DNA-encoded library，DEL）技术兼容，后者能够获得规模更大且多样性更高的组合库。总之，该工作建立了一个广泛适用的框架，可将基于亲和力的OBOC筛选转化为功能型筛选，从而实现生物活性PPI抑制剂的直接发现。

研究背景：蛋白质–蛋白质相互作用（protein–protein interaction，PPI）参与细胞信号、转录调控、免疫应答和蛋白稳态等过程，其失调与癌症、炎症性疾病和神经退行性疾病等相关；但PPI界面通常大、平坦且缺乏传统药物靶标所具有的明确结合口袋，因此PPI抑制剂发现困难。更关键的是，仅与靶标结合不等于功能抑制，化合物可能结合靶标而不破坏其与生理伙伴的相互作用，甚至稳定复合物。传统一珠一化合物（one-bead–one-compound，OBOC）筛选依据荧光标记靶标蛋白结合选择珠展示化合物，虽能高效发现靶标结合物，却可能选到结合于PPI界面之外、稳定复合物或非功能性结合的假阳性；珠表面高配体密度造成的亲合力、荧光蛋白非特异性吸附和蛋白被聚合物基质物理包埋也会产生假阳性。已有竞争性on-bead筛选、酶功能筛选、无细胞蛋白表达等方法改进了选择性或可及性，但均未将PPI破坏本身作为珠级主要选择标准。因此，研究人员将基于F?rster共振能量转移（F?rster resonance energy transfer，FRET）的PPI抑制分析与OBOC组合库整合，建立以PPI破坏而非靶标结合为主要选择标准的功能型筛选平台，并以SRC-1/STAT6为模型验证，进而探索DNA编码库（DNA-encoded library，DEL）兼容性。该研究直接鉴定出低纳摩尔级竞争性抑制剂，先导肽S6在细胞中抑制STAT6依赖转录，DNA编码对照珠实现>99%选择性富集，意义在于把传统亲和筛选转化为功能筛选，可直接富集生物活性PPI抑制剂并扩展至DEL等大规模组合筛选平台。

关键技术方法：研究人员构建Rho-SRC-1（荧光团标记的SRC-1 PAS-B结构域）与Q-STAT6-1（淬灭剂标记的STAT6衍生肽）预组装淬灭复合物，将其与OBOC库孵育，以竞争性置换导致的荧光恢复作为珠级选择读出；在拓扑分隔双层TentaGel珠外表面合成烃钉合肽（hydrocarbon-stapled peptide，经烃桥稳定α-螺旋的肽），珠内部合成线性编码肽，命中珠经串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）解码。库理论多样性435,456，采用split-and-pool合成和闭环复分解（ring-closing metathesis，RCM）安装烃钉。命中物用竞争性荧光偏振（fluorescence polarization，FP）分析表征，并经LC/MS（liquid chromatography–mass spectrometry，液相色谱–质谱）评估血清稳定性；细胞实验使用A549人肺癌细胞，经白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）刺激后以RT-qPCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，定量实时聚合酶链反应）和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）检测eotaxin-3；DNA编码对照珠经FACS（fluorescence-activated cell sorting，荧光激活细胞分选）分选和NGS（next-generation sequencing，下一代测序）分析。无临床样本队列。

研究结果：
1. Development and validation of a FRET-based OBOC screening system（基于FRET的OBOC筛选系统的开发与验证）。研究人员以SRC-1/STAT6为模型，基于结构选择标记位点，制备Rho-SRC-1和Q-STAT6-1；Q-STAT6-1滴定使Rho-SRC-1荧光浓度依赖性淬灭，10倍量近完全淬灭；已知SRC-1配体yl-2可竞争恢复荧光；在珠上，展示yl-2的阳性对照珠呈明显红色荧光，展示非结合肽的阴性对照珠无明显信号。结论：该FRET体系可作为竞争性PPI抑制的功能读出，并适用于珠基筛选。
2. Design and screening of a hydrocarbon-stapled peptide OBOC library（烃钉合肽OBOC库的设计与筛选）。研究人员设计固定关键残基、七个可变位点并含i/i+4烃钉的烃钉合肽库，理论多样性435,456；以预淬灭Rho-SRC-1/Q-STAT6-1复合物筛选约0.46倍理论多样性覆盖，获得6个阳性珠，MS/MS解码为S1–S6。序列比较显示R1偏好疏水侧链，R2/R4富集Glu/Asp等酸性残基，R5以Thr为主，R6/R7多样性最大，部分命中肽以Asp替代天然STAT6中的Leu。竞争FP显示S1–S6均浓度依赖性抑制SRC-1/STAT6，K_i为50–490 nM；S6最强，K_i=50 nM，较亲本STAT6-1提高约7倍。结论：珠上荧光反映功能性PPI破坏而非简单结合，该策略可直接发现优于模板的竞争性抑制剂并减少传统OBOC假阳性。
3. Stability and cellular activity of a hit stapled peptide（命中烃钉合肽的稳定性与细胞活性）。S6与线性STAT6-1在胎牛血清37 °C孵育，LC/MS显示线性肽2小时内过半降解而S6血清稳定性明显改善；A549细胞经IL-4刺激后，RT-qPCR显示S6浓度依赖性降低eotaxin-3 mRNA（以β-actin归一化），ELISA显示S6剂量依赖性抑制IL-4诱导的eotaxin-3分泌。结论：烃钉合赋予S6更强抗蛋白水解能力，S6在细胞中有效抑制STAT6依赖转录及下游功能反应，表明功能筛选可直接获得生物活性抑制剂。
4. Extension to a DEL-compatible selection format（向DEL兼容选择形式的扩展）。研究人员制备DNA编码对照珠：阳性S6′（S6的Lys11→Ala衍生物，仅为保持DNA完整性）和阴性N1（S6的R1–R7全部替换为Ala以消除抑制活性），并验证肽合成、DNA标签PCR扩增及S6′抑制活性。将N1与S6′珠约10:1混合（预筛92.8%对7.2%，N1约13倍过量），与预组装Rho-SRC-1/Q-STAT6-1复合物孵育后按荧光强度FACS分选，低荧光R1中N1编码序列占99.8%，高荧光R2中S6′编码序列占99.6%。结论：该功能型选择策略与DNA编码兼容，可高选择性分离功能性与非功能性配体。

讨论部分总结：讨论指出，该FRET策略只有在珠展示化合物竞争性置换Q-STAT6-1且荧光恢复的Rho-SRC-1仍结合于珠上时才产生信号，因此非特异性吸附或物理包埋本身不易造成荧光恢复，结合SRC-1但不干扰STAT6的化合物也不易被选中；S6较STAT6-1活性提高约7倍，说明可竞争既有伙伴并发现更优抑制剂；DNA编码珠中阳性和阴性序列>99%的选择性富集显示方法稳健，并提示DEL原则上可按生物功能而非仅靶标结合筛选，从而拓宽DEL在挑战性PPI等靶标上的应用。研究结论部分翻译：在此工作中，研究人员开发了一种功能型OBOC筛选平台，能够直接发现高效、竞争性PPI抑制剂。与传统基于亲和力的OBOC筛选仅依据靶标结合选择化合物不同，该平台将PPI破坏而非靶标结合确立为主要选择标准，从而在一级筛选中直接富集生物活性PPI抑制剂。将该策略应用于靶向SRC-1/STAT6相互作用的烃钉合肽OBOC库，直接鉴定出具有低纳摩尔活性的高效竞争性抑制剂。先导肽表现出增强的结构稳定性，并在细胞中有效抑制STAT6依赖的转录反应，证明功能型筛选可直接产生生物活性PPI抑制剂。此外，使用DNA编码对照珠的概念验证实验确立该策略与DNA编码兼容，并能高度选择性地区分功能性和非功能性配体。总之，该工作建立了一个广泛适用的框架，将传统基于亲和力的组合库筛选转化为功能型筛选。通过实现基于生物功能而非仅靶标结合的直接选择，该平台提供了一种通用策略，可将功能型筛选扩展到OBOC库和DNA编码库，并应有助于发现针对具有挑战性的PPI的高效、生物活性抑制剂。