IL-10分泌型工程化巨噬细胞通过巨噬细胞表型调控与肠道菌群重塑缓解DSS诱导的小鼠结肠炎

《Bioengineering & Translational Medicine》：IL-10-secreting engineered macrophages alleviate DSS-induced colitis with macrophage phenotypic modulation and gut microbiota remodeling in mice

　　

溃疡性结肠炎（UC）是一种以腹痛、便血和体重下降为特征的慢性复发性炎症性肠病（IBD）。尽管在理解UC发病机制方面已取得显著进展，但寻找更有效的治疗方法仍是挑战。白细胞介素-10（IL-10）具有强效抗炎特性，然而由于靶向性差和半衰期短，其在UC中的治疗应用在临床上未能成功。在本研究中，研究人员基于RAW264.7细胞开发了分泌IL-10的工程化巨噬细胞（IL-10M），并在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中评估其治疗效果。腹腔注射IL-10M可减轻体重下降、疾病活动度、结肠缩短和组织学损伤。IL-10M还减少黏膜损伤并改善紧密连接相关上皮屏障标志物。流式细胞术进一步在结肠组织中检测到工程化巨噬细胞相关绿色荧光蛋白（GFP）信号，并显示CD206⁺内源性结肠巨噬细胞早期增加。微生物组分析显示治疗相关组成变化，包括Bacteroides acidifaciens和Mucispirillum schaedleri的改变，表明工程化巨噬细胞治疗后肠道菌群重塑。短期安全性评估未发现明显血液学异常或肝脏和脾脏主要组织学损伤。总体而言，这些发现提示分泌IL-10的工程化巨噬细胞可能代表一种有前景的基于巨噬细胞的策略，用于减轻实验性结肠炎中的肠道炎症。

研究背景：溃疡性结肠炎（UC）是慢性复发性炎症性肠病（IBD），以腹痛、便血和体重下降为特征，全球发病率和患病率上升，公共卫生负担较重。其确切病因尚未完全阐明，通常认为与遗传易感个体对环境、上皮、微生物和免疫相关因素的不受控免疫反应有关。肠道免疫系统需在维持对饮食和菌群抗原耐受的同时对病原体产生适当应答，而促炎细胞因子（如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-23）升高及抗炎机制（功能性调节性T细胞及IL-10、TGF-β等抗炎细胞因子）受损可导致慢性炎症和组织损伤。白细胞介素-10（IL-10）是肠道稳态的关键多效性抗炎细胞因子，可抑制促炎细胞因子和趋化因子产生、促进抗炎介质分泌并抑制幼稚CD4⁺T细胞及巨噬细胞活化与增殖；IL-10或IL-10受体缺陷小鼠可发生严重自发性结肠炎，人类IL-10信号通路缺陷新生儿亦在出生后不久发生严重小肠结肠炎。既往临床前研究支持人IL-10（hIL-10）减轻IBD动物模型肠道炎症，但临床试验结果不理想，可能原因包括全身给药难以在肠组织达到有效浓度，以及同时存在的免疫刺激作用抵消其免疫抑制特性。因此，将IL-10靶向递送至炎症肠组织是重要策略。巨噬细胞是固有免疫核心成分和肠道稳态守卫者，在IBD中特定巨噬细胞群可促进炎症和组织损伤，其可塑性使其成为治疗靶点；工程化免疫细胞治疗已成为精准医学的变革性方向，巨噬细胞具有天然炎症趋化能力，可作为靶向递送治疗分子的活载体。基于此，研究人员提出分泌IL-10的工程化巨噬细胞可作为靶向治疗改善结肠炎的假设，并开展本研究。

研究概况与意义：研究人员生成IL-10分泌型工程化巨噬细胞（IL-10M），在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中评估其治疗潜力，并研究其对内源性结肠巨噬细胞相关表型和肠道菌群组成的影响。结果显示IL-10M治疗显著减轻肠道炎症，支持该细胞治疗方法作为UC有前景的治疗策略。与对照巨噬细胞（ConM）相比，IL-10M在多项疗效终点上改善更明显，提示持续IL-10分泌对工程化巨噬细胞治疗活性有重要贡献。

主要关键技术方法：研究人员基于RAW264.7细胞建立稳定表达IL-10与GFP的IL-10M及仅表达GFP的ConM；使用8周龄雄性C57BL/6小鼠（动物实验经中国人民解放军总医院实验动物伦理委员会批准，批准号SQ2024852），以2%（w/v）DSS饮水10天诱导急性结肠炎，随机分为Control、DSS+PBS、DSS+ConM和DSS+IL-10M组（每组n=6），于DSS暴露首日腹腔注射1×10⁶细胞。检测包括体重与疾病活动指数（DAI）、结肠长度、结肠/肝/脾苏木精-伊红（H&E）染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、阿利新蓝-过碘酸雪夫（AB-PAS）染色、免疫组织化学与免疫荧光、结肠固有层细胞流式细胞术、血常规以及结肠内容物宏基因组测序和生物信息学分析。

研究结果：
2.1 IL-10M减轻DSS诱导的小鼠结肠炎：通过DSS诱导结肠炎模型并腹腔给药，研究发现模型组出现明显体重下降、腹泻和便血，IL-10M治疗可稳定体重、使粪便更成形并降低DAI评分；IL-10M组结肠长度（7.42±0.47 cm）恢复至接近对照组（7.67±0.39 cm），明显优于模型组（5.35±0.32 cm）。H&E染色显示DSS导致黏膜和黏膜下层炎性细胞浸润、隐窝丢失和多发溃疡，IL-10M显著减轻炎性细胞聚集并维持结肠组织完整性，组织学评分（0.67±0.52）显著低于模型组（6.33±1.75）。ELISA显示IL-10M使IL-1β和IL-6显著下降，IL-10非显著升高，TNF-α呈非显著下降趋势。与ConM相比，IL-10M在体重恢复、DAI、结肠长度和组织学评分方面改善更明显。

2.2 IL-10M对上皮屏障完整性的保护作用：通过AB-PAS染色评估黏液产生、免疫组织化学检测紧密连接蛋白Occludin，研究发现DSS诱导后杯状细胞显著减少、黏液产生受损、Occludin表达下调；IL-10M干预恢复杯状细胞数量、黏液产生和肠道紧密连接蛋白表达，在维持肠黏膜完整性方面效率较高，而ConM对肠黏膜完整性未见显著作用。

2.3 IL-10M动态调节内源性结肠巨噬细胞相关表型：通过在第3、6、9天对结肠固有层细胞进行流式细胞术，研究发现给药后结肠组织中可检测到工程化巨噬细胞相关GFP信号，背景校正后GFP相关信号在第6天较高、第9天下降，提示其在结肠组织中短暂可检测而非持续升高。在GFP^?内源性巨噬细胞群中，IL-10M在DSS诱导结肠炎早期（第3天）增加CD206⁺细胞比例和CD206指数[CD206%/(CD206%+CD86%)]；第6天GFP^?CD86⁺细胞呈下降趋势但差异未达统计学显著。免疫荧光显示IL-10M治疗后结肠组织诱导型一氧化氮合酶（iNOS）相关信号呈降低趋势。研究提示IL-10M并非简单诱导持续M2样偏移，而是在DSS诱导结肠炎不同阶段动态调节内源性结肠巨噬细胞相关表型。

2.4 工程化巨噬细胞治疗的安全性评估：通过血常规和肝脾H&E染色评估短期安全性，研究发现IL-10M治疗显著改善UC小鼠贫血，表现为红细胞（RBC）计数和血红蛋白（Hb）水平升高；血小板计数组间无显著差异；各组总白细胞（WBC）计数均在正常范围，模型组呈白细胞减少趋势，IL-10M使WBC计数升高但未达显著；IL-10M组血单核细胞升高但仍处于正常参考范围；中性粒细胞和淋巴细胞计数均在正常范围。剖检未见腹部肿块、肿瘤样结节、明显器官增大或大体异常；IL-10M组肝脾组织学与对照组无显著差异，ConM组部分肝组织可见轻度肝细胞水肿，但未见肝细胞坏死、炎性细胞浸润等明显病理异常。

2.5 工程化巨噬细胞治疗与肠道菌群组成变化相关：通过结肠内容物宏基因组测序和生物信息学分析，研究发现模型组肠道菌群丰富度较对照组显著降低，IL-10M组呈上升趋势但差异无统计学意义；模型组均匀度（Pielou均匀度指数）显著增加，IL-10M给药后明显降低；Shannon和Simpson指数组间无统计学差异。主成分分析（PCA）和非度量多维尺度分析（NMDS）显示对照组与DSS组微生物群落明显分离，ConM和IL-10M治疗相对DSS组呈部分偏移。Venn图显示各组细菌物种数分别为Control 439、DSS 308、ConM 302、IL-10M 312。门水平上，模型组和ConM组厚壁菌门相对丰度增加、拟杆菌门减少，IL-10M组呈相反趋势；属水平上，模型组Muribaculum和CAG-485相对丰度降低、Acetatifactor和UBA3282增加，IL-10M组UBA3263、Prevotella和Duncaniella增加，COE1、UBA3282和Acetatifactor减少。线性判别分析效应量（LEfSe）分析显示，对照组富集Muribaculum faecis、Paramuribaculum intestinale和Muribaculum intestinale，模型组富集Mucispirillum schaedleri，IL-10M组富集Bacteroides acidifaciens和Duncaniella freteri。IL-10M组B. acidifaciens较DSS+PBS组增加，但ConM与IL-10M差异未达显著；M. schaedleri在DSS处理小鼠中富集，IL-10M治疗后较ConM显著降低；M. intestinale在DSS处理小鼠中耗竭，工程化巨噬细胞治疗后部分恢复，ConM与IL-10M无显著差异；IL-10M增加D. freteri相对丰度，但ConM与IL-10M差异未达显著。研究提示IL-10M干预伴随DSS诱导结肠炎肠道菌群组成重塑，但部分菌群变化可能归因于巨噬细胞载体本身，持续IL-10表达在选定菌群中提供额外作用。

讨论部分总结：研究讨论指出，IL-10M在减轻体重下降、疾病活动、结肠缩短、组织学损伤和上皮屏障破坏方面有效，且较ConM改善更明显，支持持续IL-10分泌的贡献。既往IL-10靶向肠道递送策略包括含IL-10明胶微球、分泌IL-10的工程益生菌、AMT-101及Gal-IL10-EVs等，但分别存在缺乏活动性炎症靶向、作用持续时间有限等问题。IL-10M的优势在于巨噬细胞固有炎症趋化、主动免疫调节和吞噬清除能力，以及作为IL-10等免疫调节细胞因子重要生理来源，可能将炎症趋向、局部细胞因子递送和固有免疫调节整合于单一细胞平台。流式结果提示工程化巨噬细胞在结肠组织中短暂可检测，晚期下降可能部分反映RAW264.7来源细胞在异基因C57BL/6受体中的免疫清除；内源性巨噬细胞表型呈时间依赖性调节而非简单固定M1-to-M2转换。菌群变化与炎症、屏障和微生态相互关联，但当前研究不能确定菌群变化直接促进疾病改善还是继发于炎症减轻和屏障改善，未来需粪菌移植（FMT）、抗生素清除和重定植或无菌鼠实验验证因果。终点ELISA中结肠IL-10仅非显著升高可能与采样时间有关，局部IL-10可能早期或细胞邻近发挥作用；RAW264.7来源BALB/c与C57BL/6受体异基因设置可能限制长期存留。局限包括DSS急性模型不能完全模拟人类UC慢性复发特征；CD86/CD206不能定义完整巨噬细胞极化程序；RAW264.7永生化细胞系需原代骨髓来源巨噬细胞、诱导多能干细胞来源巨噬细胞等临床相关来源及长期安全性监测；IL-10M组成型分泌IL-10，不能根据炎症微环境动态调整分泌时机和强度，未来可发展炎症响应型巨噬细胞。

研究结论（翻译）：总之，分泌IL-10的工程化巨噬细胞有效减轻小鼠DSS诱导结肠炎，并与上皮屏障相关标志物改善、内源性结肠巨噬细胞相关炎症表型调节及肠道菌群组成变化相关。该方法显示良好的短期安全性特征，可能代表一种有前景的基于巨噬细胞的免疫调节策略，用于干预肠道炎症。