臭椿木脂素A–C，臭椿中的环状木脂素

《Tetrahedron》：Ailanlignans A–C, looped lignans from Ailanthus altissima

　　

•从臭椿（Ailanthus altissima）树皮中分离得到三种此前未曾描述的环状木脂素Ailanthlignans A–C（1?3）
•通过NMR、ECD（电子圆二色性）和X射线单晶衍射数据分析确定了新化合物的绝对构型
•化合物2在浓度为7.5 μM时，通过抑制COX-2和NO的表达，表现出明显的抗神经炎症潜力。

1. 引言

臭椿属（Ailanthus，芸香科/苦木科）约有十种，是结构多样的次级代谢产物的丰富来源，包括千里光素类、三萜类、生物碱、香豆素、木脂素和苯丙素类。该属植物已被证实具有广泛的药理学活性[1,2]。

臭椿（Ailanthus altissima (Mill.) Swingle）是一种原产于中国的落叶乔木，已被广泛进行植物化学研究，从中分离出多种代谢产物，尤其是生物碱[3]、千里光素类[4]、三萜类[5]、苯丙素类和新型木脂素[6]。其中若干化合物表现出显著的生物活性，包括对癌细胞系的细胞毒性[7]、抑制烟草花叶病毒（TMV）复制[2]以及神经保护作用[8]。

尽管该物种的千里光素类成分已被充分记载，但木脂素类代谢物仍相对较少被研究。在我们旨在从中药中发现具有新颖结构的天然产物的一系列研究中[[9], [10], [11]]，我们成功地从臭椿树皮中分离得到三种此前未曾描述的木脂素——Ailanthlignans A–C（1?3）。所分离的木脂素具有独特的结构特征，即两个苯丙素单元首尾相连形成一个环，据我们所知，这是首次报道。本文详细介绍了这些新化合物的分离过程、结构鉴定以及初步的抗神经炎症活性测定结果。

2. 结果与讨论

Ailanthlignan A（1）以无色晶体形式获得。根据HRESIMS质谱中m/z 475.1576 [M+Na]+的分子离子峰，推断1的分子式为C??H??O??（C??H??NaO???的计算值为475.1575），表明不饱和度为九。红外光谱显示与O–H伸缩振动（3338 cm?1）及脂肪族C–H（sp3）伸缩振动（2929和2853 cm?1）相对应的吸收峰。1H NMR、13C NMR（表1）和HSQC波谱数据表明，1含有一组苯环信号[δH 6.40 (H-2)、6.30 (H-6)；δC 136.5 (C-1)、104.4 (C-2)、151.0 (C-3)、134.6 (C-4)、150.8 (C-5)、107.9 (C-6)]，两个甲氧基信号[δH 3.69 (5-OCH?)、3.70 (3-OCH?)；δC 55.8 (5-OCH?)、55.9 (3-OCH?)]，一个氧亚甲基信号[δH 3.89 (H-9)、3.72 (H-9)；δC 62.7 (C-9)]，以及两个氧次甲基信号[δH 4.62 (H-8)、4.12 (H-7)；δC 81.3 (C-8)、72.5 (C-7)]。

表1. 化合物1–3的1H（600 MHz）和13C（150 MHz）NMR数据。

（表格数据保留原文数值不变）

根据1H-1H COSY（图2）中H-7/H-8/H-9的相关性和HMBC（图2）中H-2与C-1/C-3/C-4/C-6/C-7、H-6与C-5、3-OCH?与C-3、5-OCH?与C-5的相关性，初步将1指定为苯丙素衍生物。然而，质谱数据显示1含有二十两个碳原子，并观察到H-8'与δC 134.6之间的HMBC相关性（图2）。因此，我们提出1是由两个苯丙素单元通过8'-O-4连接形成的内部全对称环状木脂素（图1）。

为进一步确认1的结构，通过甲醇缓慢蒸发获得适合X射线衍射的晶体。单晶X射线衍射分析（图3）成功验证了1的结构，并将其相对构型确定为7S*、8R*、7'S*、8'R*。

Ailanthlignan B（2）以无色晶体形式获得。根据HRESIMS中m/z 445.1474 [M+Na]+的离子（C??H??NaO??的计算值为445.1470），确定其分子式为C??H??O?，不饱和度为九。红外光谱显示与O–H伸缩振动（3365 cm?1）及脂肪族C–H（sp3）伸缩振动（2939和2844 cm?1）相对应的吸收峰。

1H NMR、13C NMR（表1）和HSQC波谱数据揭示2中存在两组苯丙素信号，其化学位移与1非常相似。区别在于2比1少一个甲氧基信号，提示甲氧基的缺失导致结构不对称，从而使NMR数据不重叠。根据HMBC（图2）中H-8与C-4'、H-5'与C-3'/C-4'的相关性，以及1H-1H COSY（图2）中H-5'与H-6'之间的相关性，确认C-5'位的甲氧基缺失。此外，通过单晶X射线衍射数据（图3）和ECD计算（图5）确定了2的结构和绝对构型。

Ailanthlignan C（3）与2具有相同的质谱数据和相似的1D及2D NMR数据，据此推断两者具有相似的平面结构。3中H-7/H-8的偶合常数（J = 1.7 Hz）小于1和2中的值，提示C-7和C-8处的邻二醇为赤式（threo）构型。该判断通过NOESY（图4）中H-2与H-7/H-8以及H-7'与H-2'、H-8'与H-6'的相关性得到进一步确认。这些NOESY数据证实了C-7和C-8处的threo构型，而C-7'和C-8'处的构型被确定为苏式（erythro），且H-7'质子与相邻带甲氧基碳上的质子位于同侧。为确定化合物的相对构型，我们对7R*, 8R*, 7'S*, 8'R*-3a和7S*, 8S*, 7'S*, 8'R*-3b两种异构体进行了计算NMR分析，并结合ECD计算，最终确定3的绝对构型为7R, 8R, 7'S, 8'R（图5）。

对1–3进行初步的体外抗一氧化氮活性测定，在LPS刺激的BV2小胶质细胞中进行，以30 μM的地塞米松（DXM）作为阳性对照。值得注意的是，2表现出与DXM相当的抗一氧化氮活性（图6B）。此外，2在浓度为7.5 μM时抑制COX-2的分泌（图6C）。基于化合物1–3的结构特征及其抗神经炎症活性，进行了初步的结构-活性关系（SAR）分析。这三种木脂素具有相同的8'-O-4环化骨架，但在芳环取代基和立体化学上有所不同。与活性最强的化合物2相比，化合物1在芳环C-5'位多了一个甲氧基，引入了更大的空间位阻并改变了分子极性，这可能是其抗神经炎症活性减弱的原因。化合物2与3的比较表明，两者抗神经炎症活性的差异可能主要归因于C-7和C-8手性中心的立体化学差异。此外，文献综述显示，化合物2的抗神经炎症潜力（7.5 μM）与此前报道的臭椿木脂素相当[8]，使其成为值得进一步开发的潜在先导化合物。鉴于当前的SAR推断是基于这三种化合物的细胞表型建立的，因此需要利用更广泛的结构类似物进行进一步研究，以建立更加可靠的结构-活性关系。

3. 结论

总之，对臭椿树皮进行植物化学研究，分离得到三种具有稀有8'-O-4环化骨架的新木脂素（1–3）。这些发现不仅扩展了木脂素已知化学多样性的范围，也丰富了臭椿的化学成分类型。化合物2在浓度为7.5 μM时，在脂多糖（LPS）刺激的BV2小胶质细胞中表现出明显的抗神经炎症潜力。

4. 实验部分

4.1. 一般实验方法

旋光度在PerkinElmer 241旋光仪（美国PerkinElmer公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆）上测定。单晶X射线衍射使用Bruker D8 Quest衍射仪（德国Bruker公司）测定。质谱通过Bruker tims TOF获得（德国Bruker公司，卡尔斯鲁厄）。红外光谱在Agilent Cary 600 FT-IR红外光谱仪上获取（美国Agilent Technologies公司，加利福尼亚州圣克拉拉）。UV和CD光谱在Chirascan圆二色性光谱仪上测定（英国Applied Photophysics Ltd.公司，莱瑟黑德）。NMR波谱在Bruker Avance Neo 600 MHz（德国Bruker公司，卡尔斯鲁厄）上测定，以TMS为内标。分离使用硅胶柱色谱（200-300目）和动态轴向压缩柱（中国淮安汉邦科技有限公司）进行。纯化使用NP7000制备型高效液相色谱仪（中国淮安汉邦科技有限公司），配有PrePulite Gold C18 5 μm半制备柱（10 × 250 mm）。

4.2. 植物材料

本研究使用的臭椿树皮由四川新奥特斯制药有限公司提供，经成都中医药大学高级植物学家王光植教授鉴定。样品编号为20240909，现保存在成都中医药大学标本馆（CDCM）的植物标本室中。

4.3. 提取与分离

取50 kg臭椿树皮粉碎，用95%甲醇在室温下提取三次，合并粗提物后干燥，通过正相硅胶柱色谱（200-300目）进行分级。先用石油醚-乙酸乙酯（30:1至4:1，v/v）洗脱除去脂溶性成分，再以二氯甲烷/甲醇梯度洗脱（1:0至0:1，v/v），得到十七个馏分（Fr.1-Fr.17）。Fr.8（73 g）以甲醇-水（40:60）为流动相，通过动态轴向压缩柱色谱进行分离，得到六个子馏分（Fr.8.1-Fr.8.6）。Fr.8.2（3.75 g）经硅胶柱色谱以二氯甲烷-甲醇（1:1，v/v）洗脱，得到三个子馏分（Fr.8.2.1-Fr.8.2.3）。Fr.8.2.2（1.12 g）进一步通过反相C18柱色谱分为十个子馏分。其中Fr.8.2.2.2（111.8 mg）以甲醇-水（12:88，v/v）为流动相进行半制备HPLC分离，得到六个样品。其中Fr.8.2.2.2.2（10.7 mg）和Fr.8.2.2.2.3（14.6 mg）分别以乙腈-水（8:92，v/v）为流动相进行纯化，分别得到化合物2（2.2 mg，tR = 21.9 min）和3（11.5 mg，tR = 16.5 min）。Fr.8.2.2.5（38.5 mg）以甲醇-水（12:88，v/v）为流动相进行半制备HPLC纯化，得到化合物1（10.8 mg，tR = 38.2 min）。

4.4.

光谱数据

艾兰新木脂素A（1）：从甲醇中获得的无色晶体；熔点：146–147 °C；[α]2?_D 0（c 0.04，CH?OH）；UV（CH?OH）λ_max（log ε）218（4.05），235（3.93），273（3.04）nm；IR（KBr）ν_max 3338，2929，2853，1639，1593，1460，1426，1324，1224，1124，1009 cm?1；(+)-HRESIMS：m/z 475.1576 [M+Na]?（C??H??NaO???的理论值为475.1575）。13C NMR（150 MHz，DMSO-d?）δ 151.0（C-3，3′），150.8（C-5，5′），136.5（C-1，1′），134.6（C-4，4′），107.9（C-6，6′），104.4（C-2，2′），81.3（C-8，8′），72.5（C-7，7′），62.7（C-9，9′），55.9（3-OCH?，3′-OCH?），55.8（5-OCH?，5′-OCH?）。1H NMR（600 MHz，DMSO-d?）δ 6.40（d，J = 1.9 Hz，H-2，2′），6.30（d，J = 1.9 Hz，H-6，6′），5.33（d，J = 4.5 Hz，7-OH，7′-OH），4.62（ddd，J = 9.3，5.9，2.5 Hz，H-8，8′），4.59（t，J = 6.2 Hz，9-OH，9′-OH），4.12（dd，J = 9.3，4.5 Hz，H-7，7′），3.89（ddd，J = 11.7，6.2，2.5 Hz，H-9，9′），3.72（重叠，H-9，9′），3.70（s，3-OCH?，3′-OCH?），3.69（s，5-OCH?，5′-OCH?）。

艾兰新木脂素B（2）：从甲醇中获得的无色晶体；熔点：139–141 °C；[α]2?_D ?3.3（c 0.03，CH?OH）；UV（CH?OH）λ_max（log ε）206（3.78），234（3.20），278（2.28）nm；CD（c 0.95 mM，MeOH）λ_max（Δε）210（4.14），218（?0.42），231（?0.21）；245（0.17）nm；IR（KBr）ν_max 3365，2939，2844，1593，1507，1459，1424，1325，1261，1221，1125，1014 cm?1；(+)-HRESIMS：m/z 445.1474 [M+Na]?（C??H??NaO??的理论值为445.1470）。13C NMR（150 MHz，CD?OD）δ 153.1（C-5），151.7（C-3），150.2（C-3′），148.4（C-4′），137.8（C-4），136.3（C-1），135.9（C-1′），120.8（C-5′），118.7（C-6′），115.0（C-2′），108.8（C-2），105.8（C-6），85.4（C-8′），83.6（C-8），74.1（C-7′），73.7（C-7），64.6（C-9），64.2（C-9′），56.9（3′-OCH?），56.7（3-OCH?），56.1（5-OCH?）。1H NMR（600 MHz，CD?OD）δ 6.78（dd，J = 8.5，2.0 Hz，H-5′），6.75（d，J = 2.0 Hz，H-2′），6.66（d，J = 8.5 Hz，H-6′），6.56（d，J = 1.8 Hz，H-6），6.35（d，J = 1.9 Hz，H-2），4.83（ddd，J = 9.4，5.6，2.6 Hz，H-8），4.38（ddd，J = 9.1，6.0，2.3 Hz，H-8′），4.36（d，J = 9.1 Hz，H-7′），4.35（d，J = 9.4 Hz，H-7），4.13（dd，J = 11.8，2.3 Hz，H-9′），4.08（dd，J = 11.7，2.6 Hz，H-9），3.97（dd，J = 11.8，6.0 Hz，H-9′），3.95（dd，J = 11.7，5.6 Hz，H-9），3.86（s，5-OCH?），3.84（s，3′-OCH?），3.78（s，3-OCH?）。

艾兰新木脂素C（3）：无色胶状物；[α]2?_D ?28.1（c 0.28，CH?OH）；UV（CH?OH）λ_max（log ε）204（3.76），232（3.13），277（2.23）nm；CD（c 0.95 mM，MeOH）λ_max（Δε）203（17.76），230（?9.28），247（23.86）；276（10.45）nm；IR（KBr）ν_max 3369，2922，2849，1593，1507，1458，1421，1328，1265，1219，1125，1014 cm?1；(+)-HRESIMS：m/z 445.1465 [M+Na]?（C??H??NaO??的理论值为445.1470）。13C NMR（150 MHz，CD?OD）δ 152.8（C-5），152.5（C-3），150.4（C-3′），149.5（C-4′），137.1（C-1），136.6（C-1′），135.2（C-4），120.6（C-6′），119.7（C-5′），115.4（C-2′），106.2（C-6），105.4（C-2），86.7（C-8），82.8（C-8′），73.8（C-7′），73.6（C-7），64.6（C-9′），63.9（C-9），57.1（3′-OCH?），56.7（5-OCH?），56.2（3-OCH?）。1H NMR（600 MHz，CD?OD）δ 6.79（重叠，H-6′），6.77（重叠，H-5′），6.77（重叠，H-6），6.25（d，J = 1.8 Hz，H-2），4.81（d，J = 1.7 Hz，H-7），4.79（ddd，J = 9.4，5.5，2.6 Hz，H-8′），4.72（ddd，J = 6.9，4.6，1.7 Hz，H-8），4.37（d，J = 9.4 Hz，H-7′），4.08（dd，J = 11.8，2.6 Hz，H-9′），3.98（dd，J = 11.6，7.3 Hz，H-9），3.96（dd，J = 11.8，5.5 Hz，H-9′），3.94（dd，J = 11.6，4.6 Hz，H-9），3.87（s，3′-OCH?），3.83（s，3-OCH?，5-OCH?）。

4.5. 单晶X射线衍射数据

艾兰新木脂素A（1）（CCDC：2574471）：C??H??O??（分子量 = 452.2 g/mol）由单斜排列的无色晶体结构组成，晶胞参数为 a = 9.3536（6）?，b = 11.4365（9）?，c = 10.7923（8）?。角度为 α = 90.00°，β = 101.042（3）°，γ = 90.00°。体积为 V = 1133.11（3）?3，空间群为 P1c1。分析温度为 T = 293（2）K，Z = 2。吸收系数 μ（Cu Kα）为 0.996 mm?1，共测量到8964个反射，3648个独立反射（R_int = 5.38%）。对于显著数据（I > 2σ(I)）的最终R指数为 R? = 0.0590，wR? = 0.1592；对于所有观测数据的R指数为 R? = 0.0604，wR? = 0.1618。Flack参数精修为0.33（15）。

艾兰新木脂素B（2）（CCDC：2574475）：C??H??O?（分子量 = 422.2 g/mol）由单斜排列的无色晶体结构组成，晶胞参数为 a = 33.0790（11）?，b = 9.4397（3）?，c = 15.1905（5）?。角度为 α = 90.00°，β = 111.9210（10）°，γ = 90.00°。体积为 V = 4400.4（3）?3，空间群为 C12/c1。分析温度为 T = 293（2）K，Z = 8。吸收系数 μ（Cu Kα）为 0.899 mm?1，共测量到18020个反射，4036个独立反射（R_int = 5.50%）。对于显著数据（I > 2σ(I)）的最终R指数为 R? = 0.0525，wR? = 0.1480；对于所有观测数据的R指数为 R? = 0.0565，wR? = 0.1530。消光系数精修为0.0012（2）。

4.6. 圆二色性计算

使用Conflex 8软件进行构象搜索。电子圆二色性（ECD）光谱通过Gaussian 16程序计算。应用玻尔兹曼加权后，利用SpecDis 1.71软件对各构象体的光谱进行加和，构建总理论ECD曲线。更多详情见我们之前发表的论文[10]。

4.7. 细胞培养与细胞毒性实验

采用CCK-8法评估化合物1–3对BV2小胶质细胞的抑制作用。更多详情见先前发表的论文[12]。

4.8. 一氧化氮（NO）生成量的测定

将BV2小胶质细胞以每孔2×10?个细胞的密度接种于6孔板中，过夜培养。随后，用DMSO（二甲基亚砜，Gibco）、30 μM地塞米松（DXM，Beyotime）或7.5、15和30 μM的化合物1–3预处理细胞2小时，然后加入1 μg/mL LPS（Beyotime）进行刺激。培养24小时后，使用一氧化氮检测试剂盒（Beyotime，S0021S，中国）测定NO生成量[12]。

4.9. 蛋白质免疫印迹分析

常规进行蛋白质免疫印迹（Western blotting）以检测蛋白表达。BV2小胶质细胞经LPS（1 μg/mL）和化合物2（7.5、15和30 μM）处理。实验按先前描述的方法进行[13,14]。简要步骤如下：等量蛋白经SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭后，与一抗在4°C下孵育过夜，随后与HRP标记的二抗孵育。使用增强化学发光（ECL）试剂盒显影蛋白条带，并以GAPDH作为上样对照进行标准化[15]。

4.10. 统计分析

抗炎活性数据使用GraphPad Prism 8.0.2软件进行分析。结果以三次独立实验所得的均值±标准差（SD）表示。

CRediT作者贡献声明

黄丽：撰写–初稿，调查研究，数据整理。郭达乐：撰写–初稿，验证，资金获取，数据整理。李杰：调查研究，数据整理。赵立莲：调查研究，数据整理。顾宇成：撰写–审阅与编辑。杨静：撰写–审阅与编辑，验证，监督，资金获取。

黄丽 | 郭达乐 | 李杰 | 赵立莲 | 顾宇成 | 杨静