猪精子冷冻耐受性的遗传与转录组候选因子解析

《Theriogenology》：Identification of genetic and transcriptomic factors potentially related to sperm cryotolerance in swine

　　

鉴定与猪精子冷冻耐受性潜在相关的遗传与转录组因素。总体而言，冷冻保存导致顶体完整性下降的程度强于精子活力。在猪12号染色体上鉴定到一个提示性的3.5 Mbp全基因组关联分析（GWAS）信号。另有8个候选位点分别解释精子冷冻耐受性加性遗传变异的1%～2.4%。基因表达分析鉴定到与精子冷冻耐受性相关的候选编码和非编码转录本。总体而言，候选基因主要与膜完整性、氧化应激以及线粒体和顶体生物学相关。

研究背景与问题：猪精子冷冻保存可长期保存并广泛分发优良种公猪精液，但冻融过程会降低精子活力、运动性、顶体完整性和受精力，限制其在养猪生产中的应用。冷冻损伤主要涉及热应激和氧化应激、膜失稳、线粒体功能障碍、染色质解凝和DNA断裂。精子冷冻耐受性（sperm cryotolerance）在公猪和品种间存在差异，遗传力为低至中等，提示存在遗传基础。既有全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）、蛋白质组、代谢组和转录组研究，但候选位点重叠有限，可能受样本量、分析策略、统计功效和品种差异影响。为此，研究人员以Pietrain公猪为对象，整合探索性GWAS、基因组加性遗传方差分区和RNA测序（RNA sequencing, RNA-Seq），鉴定潜在遗传与转录组因子，为理解其多基因架构及后续验证提供候选。

关键技术方法概括：样本来自三个商业猪场的103头Pietrain公猪、105份精液，采集时间为2014年9月至2017年1月，并属于前期研究队列的子集；采集血样提取gDNA。以鲜精与冻融后5 min和90 min的精子活力（VIAB）及形态异常顶体（ACRO）比值表征冷冻耐受性，经两步聚类形成Ap1—Ap4。对99份样本、371,209个常染色体单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）开展GWAS；以200-SNP窗口和基因组最佳线性无偏预测（genomic best linear unbiased prediction, GBLUP）/BLUPF90进行加性方差分区；对20份无体细胞RNA和DNA污染精子样本开展总RNA-Seq和小RNA-Seq，并进行相关分析与差异表达分析（DESeq2）。

研究结果：3.1 精子冷冻耐受性的表型特征：105份精液评估6个VIAB和ACRO比值，冻存后所有精液质量参数下降，且解冻后孵育时间延长时下降更明显；R_ACRO变异大于R_VIAB，尤其R_{ACRO_5}和R_{ACRO_FT90/f5}变异较大。15个比值两两比较中8个显著（P≤0.05），VIAB与ACRO相关均为负；R_{VIAB_5}受猪场、季节_年份和年龄影响，R_{ACRO_FT}受猪场影响。3.2 冷冻耐受性聚类特征：Ap1和Ap2各得2簇，Ap3和Ap4各得3簇；GWAS簇样本量为9～69，RNA-Seq为3～15；Ap1与Ap2显著重叠（P=0.02，59%样本同簇）；各Ap内多数比值簇间差异显著；Ap2受季节_年份影响，Ap4受年龄影响。3.3 GWAS分析：质控后保留371,209个常染色体SNP和99份样本；各性状SNP遗传力点估计为0.00～0.50，但95%置信区间均包含0；全基因组错误发现率（false discovery rate, FDR）校正后无显著SNP；染色体水平FDR校正下，Ap4在12号染色体28,143,846—31,570,824 bp发现约3.4 Mbp的提示性数量性状位点（quantitative trait locus, QTL），含81个SNP，lead SNP为rs327486118（q=0.036，MAF=0.18）。3.4 全基因组加性遗传方差分区：8个200-SNP窗口解释至少1%加性方差，位于2、3、8、9和16号染色体；最强信号位于8号染色体28.1—29.0 Mbp，解释Ap4、Ap3、R_{ACRO_FT}和R_{VIAB_FT}的1.61%～2.38%；其余区域解释1%～1.15%；这些窗口与12号染色体GWAS信号不重叠。3.5 RNA水平与冷冻耐受性比值相关：过滤后保留3,732个蛋白编码基因、191个非编码RNA和95个微小RNA（microRNA, miRNA）；FDR校正后无显著相关；名义P≤0.001下发现10个相关，涉及8个蛋白编码基因（ZMYM4、GMDS、GUCY2C、SCFD1、TPM3、CENPT、RALGPS1和HARS1）、2个小核仁RNA（small nucleolar RNA, snoRNA）及5个比值；miRNA中仅ssc-miR-139-5p与至少一个比值相关（P≤0.01）；最强相关为R_{ACRO_FT90/f5}与ZMYM4。3.6 Ap簇间差异表达分析：FDR校正后，Ap1、Ap2和Ap4分别有1、5和1个差异表达基因；SNORA36B在Ap1和Ap4均差异表达；Ap2中SMCP、CABYR、CCDC33、CIB1及小卡哈尔体特异性RNA（small Cajal body-specific RNA, scaRNA）ENSSSCG00000020555差异表达；ssc-miR-139-5p在Ap3簇间差异丰度。

讨论与结论总结：研究人员区分冷冻抗性与解冻抗性，发现冷冻步骤是主要损伤来源，顶体较活力更易受损。由于样本量小，遗传力置信区间宽，研究定位为探索性。GWAS与既往猪精子冷冻耐受性研究少有位置重叠，可能涉及品种、表型定义、分析方法和SNP阵列差异。12号染色体QTL包含CA10、COX11、KIF2B、STXBP4和TOM1L1等，原文认为TOM1L1为较有吸引力的候选。方差分区窗口包含NWD2、VPS54、NNT、SOX6、WDPCP和AHR等候选。转录组信号较弱且未与位置候选重叠，可能反映样本量有限和成熟精子转录活性较低。候选基因总体涉及顶体形成、膜完整性、线粒体功能、氧化应激、细胞骨架和钙信号。研究局限为Pietrain小队列、缺乏独立功能验证，发现应视为假设生成。结论翻译：本研究为越来越多的证据提供补充，支持猪精子冷冻耐受性具有可利用当前基因组学方法探索的遗传和分子基础。尽管这些初步发现为未来研究提供了基线，将更大多品种队列与功能验证相结合，将是全面揭示调控猪精子冷冻耐受性机制的关键。