《VIEW》：Zero-shot learning enabled image enhancement in Bessel beam light sheet fluorescence microscopy
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摘要专业翻译
贝塞尔光束（Bessel beam）相较于光片荧光显微成像（light sheet fluorescence microscopy, LSFM）中常规高斯光束，具有更优的景深和自愈特性，可提升轴向分辨率和光学层切能力。然而，其旁瓣会产生显著的离焦
摘要专业翻译
贝塞尔光束（Bessel beam）相较于光片荧光显微成像（light sheet fluorescence microscopy, LSFM）中常规高斯光束，具有更优的景深和自愈特性，可提升轴向分辨率和光学层切能力。然而，其旁瓣会产生显著的离焦荧光，从而降低图像对比度和信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）。在此背景下，研究人员展示了一种基于物理引导的无监督深度学习模型图像复原流程，用于贝塞尔光束LSFM图像，以抑制旁瓣诱导的伪影，且无需真实数据（ground-truth）。利用Debye?Wolf模型及基于显微镜光学参数的波动光学仿真，模拟了贝塞尔光束LSFM的合成点扩散函数（point spread function, PSF）。随后，将所建PSF与混合零样本去卷积（zero-shot deconvolution）及U-Net模型相结合，对荧光生物样本图像进行去噪和对比度增强，无需成对的真实数据。深度学习模型的参数经过优化，在不同生物标本（即小鼠肾脏组织（体外）和猪眼样本小梁网三维图像堆栈（离体））上获得了显著的图像质量提升，SNR最高提升2.2倍，Michelson对比度提升89%。此外，还考察了该方法在中等PSF失配条件下的稳健性。所提出的方法在利用LSFM的各种生物医学成像应用及亚细胞动力学监测中具有重要潜力。
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一、研究背景与问题
光片荧光显微成像（light sheet fluorescence microscopy, LSFM）已成为一种重要的生物医学成像技术，能够以低光毒性和低光漂白实现活体生物样本的高速三维可视化。与传统的宽场和共聚焦显微技术相比，LSFM通过将照明限制在超薄光学切片内，并在与照明正交的平面上检测荧光，大幅减少了对光敏样本的损伤，从而支持更长的观测时间和动态生物学过程的定量分析。
LSFM的成像性能取决于用于生成光片的照明光束特性。贝塞尔光束（Bessel beam）相比常规高斯光束具有显著优势：其拥有狭窄、无衍射的中央核心，并具备绕过障碍物后自重建的能力，从而能够生成在较长传播距离内保持形状的超薄光片。这些特性带来了更优的轴向分辨率和在散射样本中更深的穿透能力，在不牺牲分辨率的前提下扩大了成像体积。上述优势已被应用于诊断领域，尤其是眼科学。
然而，贝塞尔光束固有的旁瓣会激发离焦平面，增加背景荧光，从而降低轴向层切能力和图像对比度。为抑制旁瓣诱导的伪影，研究人员已投入大量努力，涵盖光学方法和计算方法两方面。例如，Jia等人通过双扫描标记eGFP的小鼠脑样本，将轴向分辨率从1.68 μm提升至1.07 μm，但双扫描和相减操作会引入模糊和噪声。Bai等人采用压缩盲去卷积与去噪方法实现噪声抑制和分辨率增强，但基于互补光束相减（complementary beam subtraction, CBS）的光片需要双扫描，增加了生物样本的光漂白和光毒性风险。
计算图像重建方法正越来越多地用于改善显微图像质量。传统基于解析模型的重建方法范围有限，无法涵盖显微图像的全部统计复杂性。深度学习已成为显微成像中的变革性工具，在图像去噪、去卷积、超分辨、光谱解混和图像配准等关键任务中取得了显著进展。然而，监督式深度神经网络的性能依赖于大量高质量训练数据的可用性，而某些生物样本难以获得此类数据。零样本学习（zero-shot learning）技术使人工智能模型能够识别或分类训练中从未遇到过的类别数据，正在机器学习领域日益受到重视。Qiao等人开发的零样本去卷积网络（ZS-DeconvNet）无需真实数据即可实现光学荧光显微图像的去噪和分辨率增强，并在共聚焦显微镜、三维宽场显微镜、全内反射荧光显微镜和晶格光片显微镜等多种模态中得到了验证。
计算重建和零样本去卷积方法的性能关键取决于显微镜点扩散函数（point spread function, PSF）的精确建模。PSF包含图像形成的所有重要信息，包括噪声和像差来源。通过荧光微球的z-stack成像实验获取PSF可能具有挑战性且易产生误差。因此，精确的理论PSF建模对于利用零样本去卷积网络实现良好的SNR和对比度增强至关重要。
二、研究内容与结论
针对上述问题，研究人员提出了一种用于贝塞尔光束LSFM的混合零样本去卷积流程，包括利用Debye?Wolf分析和Biobeam仿真建模仪器匹配的PSF。该无监督方法能够在无需真实数据的条件下，抑制扫描式LSFM中特定的贝塞尔光束旁瓣诱导伪影。流程进一步整合了基于带限Richardson?Lucy去卷积的非盲图像复原工作流，并辅以Hessian正则化、早停和强度裁剪。
研究在多种荧光生物样本上进行了验证，包括小鼠肾脏组织（体外）和猪眼样本小梁网三维图像堆栈（离体）。定量评估采用归一化强度线剖面分析、SNR和Michelson对比度等指标。结果表明，该方法在SNR和对比度方面均获得了显著提升：小鼠肾脏样本中SNR最高提升2.2倍，Michelson对比度最高提升89%；猪眼小梁网三维堆栈中SNR提升32%，Michelson对比度提升10%。此外，研究还考察了中等PSF失配条件下方法的稳健性，发现该方法在5%半高全宽（full width at half maximum, FWHM）失配时仍能定性有效地工作，但定量精度可能受到限制。
三、关键技术方法
研究人员采用了以下主要关键技术方法：其一，基于Debye?Wolf积分和环形光瞳设计的PSF建模，利用Biobeam开源软件包进行波动光学仿真，结合显微镜光学参数（物镜数值孔径、波长、折射率、像素尺寸）生成仪器匹配的PSF；其二，零样本去卷积框架，采用两阶段设计，将低SNR超分辨任务依次分解为去噪和去卷积两个子任务，通过图像重腐蚀方法合成监督信号，无需配对真实数据；其三，二维图像使用简化U-Net模型，三维图像堆栈使用三维残差通道注意力网络（Residual Channel Attention Network, RCAN）作为骨干模型，并引入间隙修正正则化（gap amending regularization, GAR）以修正输入与目标之间的不一致性；其四，非盲图像复原工作流，包含带限Richardson?Lucy去卷积、Hessian正则化、早停和强度裁剪等约束。样本来源方面，猪眼样本取自当地屠宰场，在提取后8小时内完成成像记录。
四、研究结果
4.1 贝塞尔光束LSFM的分辨率测量
研究人员通过USAF-1951分辨率测试卡在反射模式下成像评估了显微镜的横向分辨率，可清晰分辨第9组第1元素线条，对应横向分辨率为0.977 μm。由于相干激光照明产生的相干伪影影响分辨率判定，研究人员进一步使用白光光源配合500 nm长通滤光片模拟荧光成像条件，对Siemens星靶成像并计算调制传递函数（modulation transfer function, MTF），测得截止对比度为0.15时的空间频率为0.38 lp/pixel，对应分辨率为0.85 μm。
4.2 Biobeam中贝塞尔光束LSFM PSF的仿真
研究人员使用Biobeam软件进行PSF仿真，采用(256, 256, 256)立方体网格，体素尺寸为0.325 μm/像素（横向）和0.3 μm（轴向），波长根据成像模式设定（荧光模式520 nm，反射模式488 nm）。通过实验测得的横向分辨率计算得到环形光瞳的中心数值孔径为0.287，进而推导出内、外数值孔径分别为0.215和0.312。仿真结果展示了贝塞尔光束PSF的横向和轴向强度分布，验证了环形光瞳结合Debye?Wolf模型生成贝塞尔类光束的物理一致性。
4.3 荧光生物样本的二维零样本去卷积结果
研究人员对小鼠肾脏切片样本（ThermoFisher, FluoCells F24630）进行二维成像和非盲去卷积。样本包含16 μm冷冻切片，使用Alexa Fluor 488偶联麦胚凝集素（WGA）标记肾小球和曲小管结构，Alexa Fluor 568鬼笔环肽标记丝状肌动蛋白。在曲小管区域，SNR从约9.9提升至15（1.5倍），Michelson对比度从约0.45提升至0.85（89%增强）。在肾小球区域，SNR从约13提升至29（2.2倍），Michelson对比度从约0.65提升至0.92（42%增强）。归一化强度剖面显示峰位保持稳定而谷值显著加深，表明算法恢复了被衰减的空间频率而非移动或发明新结构。
4.4 荧光猪眼样本的三维零样本去卷积结果
研究人员使用0.2%（重量/体积）荧光素钠溶液染色的猪眼样本小梁网三维图像z-stack验证三维重建能力。输入堆栈包含8个切片，z轴步长为10 μm。去卷积后，结构呈现更强的连续性，暗间隙更干净，明亮脊线更锐利且无明显噪声放大。SNR从6.5提升至8.6（32%相对增益），Michelson对比度从0.60提升至0.66（10%增强）。这些改进可增强青光眼早期检测和治疗的效果。
4.5 PSF失配对荧光图像去卷积的影响
研究人员使用故意失配的PSF（中央瓣FWHM比匹配PSF高5%）重复图像重建，以量化建模误差的影响。定性上，两种结果在大部分区域相似，但归一化强度剖面显示失配PSF的结果与匹配PSF存在系统性偏差，峰幅和谷深在多处特征上发生明显变化，表明PSF失配改变了去卷积过程中的有效对比度传递，可能导致精细结构衰减或失真。
4.6 网络训练与保真度分析
实验在NVIDIA GeForce RTX 2060 GPU上使用TensorFlow 1.15.0和cuDNN 7.4.1进行，每个数据集优化50?100个epoch，每epoch 200个更新步，批大小为4，补丁尺寸为128 × 128像素，对应约10,000?20,000个优化步骤。二维和三维模型的训练时间分别约为1小时和2小时。复原流程包含PSF数据一致性、Hessian正则化、光学通带限制、早停和强度裁剪等约束，但研究人员指出这些约束不能完全保证无伪影和结构幻觉，复原特征应针对原始测量进行交叉验证。
五、讨论与结论
研究讨论部分指出，所提出框架的关键局限性在于去卷积阶段依赖静态仿真PSF。在长时间成像过程中，样本漂移、机械不稳定、振镜扫描误差或折射率失配可能导致轴向离焦，使PSF精度受损，进而引起分辨率下降、对比度损失和重建伪影。研究人员建议采用硬件?软件协同设计，结合实时离焦估计和主动校正策略以实现动态PSF更新。此外，PSF失配分析仅代表初步稳健性评估，厚生物样本中散射和折射率异质性引入的空间变化像差远比均匀PSF展宽复杂，未来可考虑结合空间变化PSF模型或自适应光学启发的前处理模块。
研究结论部分指出，研究人员报告了一种基于零样本学习的去噪和去卷积流程，用于增强贝塞尔光束LSFM图像的SNR和对比度。通过Debye?Wolf积分分析环形光瞳设计，并利用Biobeam仿真验证生成LSFM的PSF。将仪器匹配PSF的非盲去卷积与单图像自监督去噪相结合，可稳健抑制低频雾霾同时保持边缘。在荧光小鼠肾脏切片和猪眼小梁网三维图像堆栈中，该模型展示了微结构边界的锐化、相邻特征间局部调制的增强以及斑驳背景的抑制。定量上，SNR和Michelson对比度显著提升，强度线剖面显示谷深增加而无峰位偏移，表明处理后无图像失真。最大SNR和Michelson对比度改进出现在小鼠肾脏切片肾小球区域，分别达2.2倍和42%增强。三维零样本去卷积结果显示SNR提升32%，Michelson对比度提升10%。该方法可进一步扩展至更先进的架构，如Richardson?Lucy网络，未来结合多视角或光场检测架构可进一步增强光子受限条件下的去噪性能。
