纸基微流控架构增强杂交链式反应（HCR）实现未稀释血清中miRNA-21的直接电化学检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Direct Electrochemical Detection of miRNA in Undiluted Serum by Hybridization Chain Reaction Enhanced by Paper-Based Architecture

　　

在未处理血清中实现了miRNA-21的直接杂交链式反应（HCR）电化学检测；纸基装置集成样品传输、试剂储存、HCR和检测；毛细流HCR隔离氧化还原标记，产生强信号关闭（signal-off）响应；该平台将检测限（LOD）从约100 pM改善至缓冲液中7 pM和血清中10 pM。

研究背景方面，循环miRNA（microRNA，内源性非编码小RNA）是肿瘤学中的非侵入性生物标志物，可通过液体活检（liquid biopsy）获取肿瘤分子特征，较传统组织活检患者不适更少。miRNA-21是原型致癌miRNA（oncomiR），在乳腺癌、结直肠癌、胃癌和宫颈癌中明显上调，血清和血浆miRNA-21水平与癌症进展及治疗反应相关，故适合作为癌症筛查和治疗随访的液体活检标志物。然而，血清中miRNA直接检测仍具分析挑战：循环miRNA浓度低，且与蛋白质、脂质和电解质等复杂背景共存，会导致基质诱导变异和灵敏度降低；稀释或固相萃取等预处理虽可减轻干扰，却会削弱目标分析物并引入变异，增加标准化难度和成本。RT-qPCR（逆转录定量PCR）灵敏度高但需热循环和特定试剂，Northern blot和微阵列有多重分析能力但存在交叉杂交及血清兼容性限制，流式检测外泌体miRNA-21需荧光标记和特定光学设备。HCR（hybridization chain reaction，杂交链式反应）为无酶等温扩增，依赖发夹DNA经toehold介导链置换形成长双链聚合物并携带报告标签，适合即时检测（POC）。研究人员此前在聚酯背衬丝网印刷电极（SPEs）上用HCR检测磷酸盐缓冲液（PBS）中的miRNA模拟物，检测限约100 pM，但在未稀释血清中基质干扰严重，提示仅靠HCR不足以克服基质导致的信号恶化，需要样品管理和生物界面控制；纤维素纸平台具有毛细驱动流体分布、试剂限制和样品处理集成优势，可能改善复杂基质中的测量稳健性。基于此，研究人员开发了全集成纸基微流控电化学测定，在3 cm通道内直接进行HCR扩增，无需样品制备即可检测未稀释血清中的miRNA-21；装置以蜡打印在Whatman Grade 1纸上形成亲水通道，并丝网印刷碳和Ag/AgCl墨水构建三电极，中央储液器预载等量亚甲基蓝（MB；methylene blue，氧化还原电活性标记）标记的H₁和H₂发夹，血清样品推进时再水化探针，目标触发HCR形成含多个MB标记的延伸DNA组装体，降低MB电化学可及性并产生信号关闭响应；纸通道中HCR产物下游传输效率较低可能进一步增强信号关闭并解释LOD改善。该工作意义在于以低成本、无酶扩增和微流控设计实现复杂生物基质中的可靠miRNA检测，为分散式液体活检提供实用策略。

关键技术方法方面，研究人员采用蜡打印在Whatman Grade 1滤纸上制作3.0 cm×0.2 cm亲水通道，连接入口储液器、中央试剂储液器和末端检测区；手动丝网印刷Ag/AgCl伪参比/导电轨道及碳工作/对电极，工作电极直径0.4 cm，背面粘附聚酯背衬防漏。中央储液器预载5 μL含1 μM H₁和1 μM H₂的溶液并干燥；加入50 μL缓冲液或未稀释人血清后毛细驱动再水化，反应区终浓度各100 nM，25 min完成。未稀释人血清来源于人男性AB血浆（USA origin，无菌过滤，Cat. No. H4522-100ML，Sigma-Aldrich），研究未涉及患者来源内源样本。检测用便携恒电位仪和多路复用器，方波伏安法（SWV；square-wave voltammetry）参数为频率50 Hz、平衡5 s、步电位0.001 V、振幅0.01 V、0~?0.5 V；以ΔS(%)=[(I₀?I_target)/I₀]×100定量，血清校准以未加标血清为I₀，加标回收设0.5、3、15、75 nM并三次重复；用K₃[Fe(CN)₆]作流体传输模型，并比较自由H₁/H₂与预形成HCR产物的迁移。

研究结果部分保留原文小标题如下。3.1 纸微流控通道表征（Characterization of the Paper Microfluidic Channel）：通过蜡处理接触角测定和彩色溶液铺展实验，发现蜡处理区域接触角约106°，未处理纸发生横向扩散而蜡图案将液体限制于亲水通道，证实疏水屏障有效；以K₃[Fe(CN)₆]为模型电活性探针比较2、3、4、5 cm通道，切取末端、干燥、再溶于0.1 M KCl并用循环伏安分析，发现2 cm虽润湿快但总信号低于3 cm，5 cm因分散和保留导致电流较低，3 cm在15 min给出最高回收电流和良好重现性；引入中央亲水储液器并预载干燥K₃[Fe(CN)₆]后，电流在25 min最高且之后不再提高，故最终采用3 cm通道、中央储液器和末端集成三电极，结论是其在毛细流、试剂储存/释放和25 min操作窗口间取得实用折中。3.2 分析参数优化（Optimization of Analytical Parameters）：通过在最终集成装置上监测MB电流，发现H₁/H₂再水化后电流10~25 min逐渐增加，25 min最高，短于10 min不能完全润湿工作电极；在50 nM miRNA-21存在下，25 min已出现明显信号关闭，延长至30 min仅略增但变异增大，40和50 min信号变化反而下降，故选25 min；入口体积30、50、70 μL比较中，30 μL润湿和再水化不足导致信号较低，50 μL明显改善，70 μL无实质优势且扩散更大，故选50 μL；3 cm（储液器至检测区1.35 cm）与4.5 cm（2.7 cm）比较均出现目标依赖电流下降，4.5 cm百分比信号变化略高但绝对电流较低，更易受背景波动和器件间变异影响，故选3 cm；自由H₁/H₂与预形成HCR产物经3 cm通道迁移比较显示，自由探针回收电流始终高于HCR产物，结合无纸通道直接测量，支持HCR组装体在纤维素网络中下游传输效率较低或保留较多，结论是纸通道传输行为对信号关闭有贡献，但综合信号稳定性选择3 cm。3.3 分析性能表征（Analytical Performance Characterization）：缓冲液中0.01~400 nM miRNA-21校准由5个独立器件获得，信号变化随浓度对数呈S形，R²=0.988，低浓度0.01~2 nM呈线性，回归方程y=8.422x+16.74（R²=0.92），采用四参数Hill函数拟合并以最大实验信号变化的10%为阈值，LOD为7 pM，较此前聚酯SPEs约100 pM明显改善；对照实验显示H₁、H₂单独100 nM的MB峰相似且低于H₁+H₂条件（反映总MB探针浓度差异），miRNA-21单独50 nM无MB峰，非目标miRNA-644a 50 nM接近H₁+H₂对照而miRNA-21 50 nM显著降低MB峰，支持信号关闭与特异目标触发HCR相关；选择性实验中非互补miRNA-644、miRNA-205、miRNA-200、miRNA-143、miRNA-125各0.1 nM信号变化≤2%，miRNA-21约16%。未稀释人血清中同样0.01~400 nM校准，以未加标血清为基线，浓度依赖信号关闭保留，Hill拟合R²=0.991，LOD为10 pM；低浓度0.01~2 nM线性回归y=4.030x+10.835（R²=0.92）；加标回收在0.5、3、15、75 nM三次重复下为99.1~102.0%，相对标准偏差（RSD；relative standard deviation）1.7~8.5%；未稀释血浆亦保留浓度依赖信号关闭，LOD为60 pM；50 nM时RSD在缓冲液为3%、血清为6%（n=5）。作者指出本研究使用合成miRNA-21，未包含患者来源内源miRNA-21样本，因而建立的是未稀释生物基质中的分析性能而非临床验证，后续需患者样本及RT-qPCR对照。结论是纤维素纸基替换聚酯后提高了分析性能，可在25 min内直接检测未稀释血清且避免此前基质干扰。3.4 储存稳定性评估（Storage Stability Assessment）：通过将H₁和H₂预载中央储液器、暗室室温储存0、3、5、10、14天后加入miRNA-21触发HCR，发现绝对峰电流逐渐下降，H₁/H₂参考由约0.27降至0.18 μA，HCR条件由约0.125降至0.09 μA，14天保留约65~70%；用于定量的百分比信号变化仅由约54%降至48%，基本稳定，结论是预载发夹试剂在暗室环境至少14天保持分析性能，利于制造、分销和现场部署；与代表性电化学miRNA传感方法比较，部分方法通过纳米结构电极、探针固定、纳米颗粒报告或额外扩增获得更低LOD，但流程更复杂或更长，而本平台25 min、预载H₁/H₂、无需电极探针固定或样品预处理，可直接分析未稀释血清。

讨论部分总结：纸通道在该平台中不仅是流体传输支撑，而是参与分析过程，协调样品芯吸、干燥探针再水化、HCR发展和末端印刷电极电化学读出；测定无需洗涤，操作中无需额外试剂，并保持便携核酸分析所需的简便性和稳健性。信号关闭可归因于目标诱导HCR产物降低MB标记电化学可及性，纸基中H₁/H₂与HCR产物不同传输行为进一步支持该效应。关键成果是平台可直接在未稀释血清中操作，缓冲液和未处理血清均达皮摩尔灵敏度，克服强基质稀释需求。研究结论部分翻译如下：将HCR扩增整合到纸基电化学微流控形式中，为改善生物相关基质中的miRNA检测提供了实用途径。在该平台中，纸通道不仅是流体传输的支撑，而且通过协调样品芯吸、干燥探针再水化、HCR发展和末端印刷电极的电化学读出，成为分析过程的一部分。该配置实现了无需洗涤的测定，操作过程中无需额外试剂，同时保持了便携式核酸分析所需的简便性和稳健性。装置中观察到的信号关闭响应可归因于目标诱导的HCR产物形成，当发夹探针转化为延伸DNA组装体后，MB标记的电化学可及性降低。在纸基形式中，该效应还受到H₁/H₂探针与HCR产物在纤维素网络内不同传输行为的进一步支持。比较迁移实验与HCR组装体相较于自由H₁/H₂探针较低的下游传输效率一致，这可能有助于增强信号关闭响应。该平台的关键成果是能够直接在未稀释血清中操作。该测定在缓冲液中达到皮摩尔灵敏度，并在未处理血清中保持相当性能，克服了强基质稀释的需求。总体而言，所提出的纸基HCR装置朝着更简单、更自主的循环miRNA电化学检测迈出了一步。通过结合无酶扩增、毛细驱动操作、试剂储存和集成电化学读出，该平台为分散式液体活检应用提供了有前景的基础。未来工作应集中于临床样本验证、内源性miRNA水平评估以及将该形式适配于癌症相关生物标志物的多重panel。