探针优先、描绘其次：全面解析巨噬细胞极化的高通量筛选策略

《SLAS Discovery》：Probing and painting to get the full picture of macrophage polarisation

　　

巨噬细胞在组织修复与重塑、宿主防御和免疫病理中发挥核心作用。其响应局部信号快速重编程关键功能的能力使其成为药物发现有吸引力的靶点。虽然这种可塑性创造了治疗机会，但同时也使高通量筛选复杂化，因为多种短暂的功能状态可能共存。为应对这一挑战，研究人员开发了一种384孔单细胞流程，利用两种公认的生物标志物——诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）和精氨酸酶1（Arginase 1, Arg₁）——作为巨噬细胞状态的紧凑型主要读出指标。研究人员将该靶向方法与无偏图像分析、Cell Painting和ChromaLIVE进行了基准比较。在一项先导筛选中，该生物标志物组合迅速识别出具有生物学意义的不同命中类别。描绘方法提供了互补的高维信息，有助于解决模糊判定，但计算成本更高。探针优先、描绘其次的工作流程能够最佳平衡通量、生物学可解释性和计算效率，从而支持巨噬细胞调节剂的可规模化发现。

巨噬细胞在组织修复与重塑、宿主防御和免疫病理中发挥核心作用，其响应局部信号快速重编程关键功能的能力使其成为药物发现的重要靶点。然而，巨噬细胞群体内多种短暂且共存的功能状态使高通量筛选复杂化。经典的M1/M2极化模型虽是对体内复杂连续体的简化，但仍是系统筛选的有用实验框架。当前缺乏可扩展且功能相关的筛选平台，以在保持相关表型信息的同时过滤生物噪声，因此需要开发新的筛选策略。

研究人员建立了基于两种成熟生物标志物——诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶1（Arg₁）——的384孔单细胞高内涵成像平台，同时并行运行Cell Painting和ChromaLIVE两种非靶向高维图像分析方法。通过在同一筛选背景下比较“探针”与“描绘”策略，旨在确定哪种方式能为高通量发现提供最清晰和可操作的信息。

关键技术方法包括：从C57BL/6小鼠骨髓制备骨髓来源巨噬细胞（BMDM）作为样本来源；在384孔板中建立M0（未刺激）、M1（脂多糖+干扰素-γ）和M2（白细胞介素-4+白细胞介素-13）三种极化背景。靶向探针采用免疫荧光检测iNOS/Arg₁；描绘方法包括固定细胞的Cell Painting和活细胞的ChromaLIVE。利用高内涵显微成像系统采集图像，CellProfiler提取单细胞形态、强度、纹理等特征。采用随机森林（RF）分类器进行状态分类，通过交叉验证调整超参数，并评估了不同训练细胞组成策略。先导筛选包含25个化合物，在极化6小时后给药，24小时固定成像。

结果部分：

4.1 识别区分巨噬细胞状态的探针（Identifying probes that discriminate macrophage states）

研究人员先用CellMask和罗丹明-鬼笔环肽染色评估细胞形态，发现仅凭细胞面积、偏心率和形状因子等形态参数不能可靠区分M0、M1、M2。随后验证iNOS和Arg₁生物标志物：流式细胞术确认M1极化上调iNOS、M2极化上调Arg₁；高内涵成像在24小时能清晰分离三种状态，而48小时信号显著减弱，表明这些酶的表达具有瞬时性。

4.2 探针优先的先导筛选（Probe-first pilot screen）

在24小时终点，依据M0对照孔设置的荧光强度阈值，细胞被分为M0样、M1样、M2样和iNOS/Arg₁共表达四类。25个化合物处理后，根据其对三种极化背景的影响，被归为抗炎、促炎、极化抑制、未知和无效应五类。7个化合物在高低剂量均显示抗炎活性，包括视黄酸、盐酸去甲乌药碱、邻菲咯啉等；MK-8722在两种剂量均被归为促炎；2-脱氧-D-葡萄糖、抗霉素A和衣康酸等被归为极化抑制剂。TM5275表现出剂量依赖性效应。共表达细胞群比例虽小但可重复。该检测能识别真实抗炎命中，但也暴露出M1井中iNOS信号饱和、部分化合物剂量依赖行为不一致等局限。

4.3 加入描绘方法（Adding some paint to the mix）

研究人员在同一条件下运行Cell Painting和Chroma，训练随机森林分类器。时间过程分析显示M0、M1、M2的形态学分类在24小时达到峰值，M2信号随后迅速衰减。研究评估了三种训练细胞组成策略，并选择在测试集上准确率最高的策略用于下游分析。Cell Painting与Chroma在M0和M1分类上一致性较高（Pearson r分别为0.85和0.86），M2一致性较低（r=0.53），高剂量处理后一致性进一步下降。与生物标志物基准相比，低剂量下Cell Painting和Chroma的命中标签一致率分别为56%和48%。所有平台均检测到抗霉素A、2-DG和衣康酸。描绘方法能提供亚细胞组织、纹理和强度等互补信息，例如Acevaltrate在生物标志物筛选中被归为“未知”，但描绘方法提示其增加M0样细胞比例。促炎命中率低的现象在所有平台重现，提示在现有实验体系中药物性促进M1表型本质上困难。

讨论部分指出，聚焦的生物标志物检测具有低计算开销和清晰判定，适合作为可扩展的一级筛选；描绘方法提供高维信息，有助于解决模糊或微妙的效应，但图像数据和计算成本高，可能成为瓶颈。因此，“探针优先、描绘其次”的工作流程能在通量、生物学可解释性和计算效率间取得最佳平衡。后续验证将结合多重细胞因子/趋化因子检测和MAC-seq转录组学，并在人巨噬细胞中确认。

研究结论：研究人员报道了一种新的高通量筛选，能够捕捉快速变化、共存的巨噬细胞表型，以识别可有效重编程激活状态的化合物。通过比较iNOS/Arg₁生物标志物与无偏描绘方法，验证了该筛选在通量、可解释性和表型分辨率上的性能。数据表明，聚焦的生物标志物检测足以标记异质群体中化合物诱导的扰动，而描绘方法提供互补信息。总体而言，探针优先、描绘其次的工作流程最佳平衡了速度、可解释性和机制洞察。