评估人源CAR-NK细胞对多种犬类肿瘤细胞系的细胞毒性

《Research in Veterinary Science》：Assessment of cytotoxicity of human CAR-NK cells against various canine tumor cell lines

　　

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  高效生产人源iPSC衍生的、经过基因编辑的CD19 CAR（FMC63）-iNK细胞是可行的。
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  犬B细胞白血病细胞（GL-1）表面可以表达CD19蛋白。
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  CD19 CAR（FMC63）-iNK细胞对GL-1细胞分泌高水平的IFN-γ，并表现出剂量依赖性的细胞毒性。
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  将人源CAR-iNK细胞用于治疗犬类肿瘤似乎是可行的。

引言

在人类医学中，免疫细胞疗法已成为治疗癌症最有前景的方法之一，尤其是在对传统治疗方法（如化疗、手术或放疗）无反应的情况下。随着免疫细胞疗法受到关注，人们一直在努力增强免疫细胞的功能，主要通过使用编码嵌合抗原受体（CARs）的T细胞来实现，这些T细胞在血液系统恶性肿瘤（如B淋巴细胞淋巴瘤）的治疗中表现出有效性（Chavez等人，2019年）。然而，CAR-T细胞疗法存在一些局限性：它在治疗实体瘤方面效果较差，并且可能引起严重的不良反应，例如细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性和移植物抗宿主病（GvHD）。

自然杀伤（NK）细胞是一种能够有效杀死异常细胞（如病毒感染的细胞或肿瘤细胞）的免疫细胞（Caligiuri，2008年；Morvan和Lanier，2016年）。与T细胞不同，NK细胞在异体移植环境中不会诱发GvHD、CRS或神经毒性，因此适合直接使用（Morvan和Lanier，2016年；Romee等人，2016年）。此外，使用CAR-NK细胞治疗血液系统和实体瘤的试验结果令人满意，表明NK细胞疗法可能成为T细胞疗法的替代方案（Bollino和Webb，2017年）。

在过去的十年中，大多数使用NK细胞治疗肿瘤的试验依赖于NK-92细胞。然而，由于NK-92细胞来源于淋巴瘤，因此在使用前必须对其进行辐照以防止其不受控制地增殖，这可能会限制其持久性和治疗效果。诱导多能干细胞（iPSCs）为NK细胞提供了一个有前景的替代来源，而iPSC衍生的CAR-NK细胞在血液系统和实体瘤的治疗中都显示出了良好的效果（Li等人，2018年）。

最初，研究人员利用患者自身的免疫细胞来生成免疫细胞产品以防止免疫排斥反应。但由于自体免疫细胞疗法耗时且成本高昂，因此产生了对即用型免疫细胞产品的需求。为了生产即用型低免疫原性的免疫细胞，研究人员探索了多种方法，包括敲除与人类白细胞抗原I类和II类表达相关的基因、编码T细胞受体（TCRs）的基因以及过表达“不要吃我”信号相关的基因。此外，敲除与免疫检查点相关的基因可以增强免疫细胞的细胞毒性（Rupp等人，2017年；Stenger等人，2020年；Wang等人，2021年；Zhang等人，2019年）。

尽管在人类医学领域取得了这些重要进展，但由于缺乏在兽医领域应用免疫细胞疗法的研究，兽医医学并未从中受益相同程度。根据ClinicalTrials.gov的数据，目前有超过1600项正在进行的CAR-T细胞相关试验，7种获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CAR-T产品，以及超过90项使用CAR-NK细胞治疗人类各种类型肿瘤的试验。相比之下，在兽医医学领域，只有少数（<30项）使用CAR-T细胞的研究，其中大多数针对淋巴瘤，这表明兽医领域的应用仍然远远落后于人类医学。在这种情况下，将人源免疫细胞用于异体动物似乎在成本和时间上都是高效的。

我们之前使用多重基因编辑技术，通过敲除TCR、II类主要组织相容性复合体转激活因子（CIITA）和β2微球蛋白（B2M）基因，生成了低免疫原性的CAR-iPSC衍生的NK细胞（Kwon等人，2024年）。为了增强细胞毒性，还敲除了免疫检查点基因程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4），并过表达了针对CD19的嵌合抗原受体。此外，还过表达了“不要吃我”分子CD24，以提高这些细胞逃避免疫系统的能力。这些细胞被称为通用高效CAR-iPSC衍生的NK细胞（upCAR-NK细胞）。

我们假设这些细胞可以在异体动物条件下应用，因为与免疫识别和排斥相关的多个基因已经经过基因改造。为了评估这种应用的可行性，我们首先证明了人源upCAR-NK细胞对犬类肿瘤细胞系（包括来自血液系统和实体瘤的细胞系）具有强大的细胞毒性。基于我们的结果，我们认为针对人类CD19的CAR可能也对犬类CD19有效。

章节摘要

生成经过基因编辑的人源iPSC衍生NK细胞

NK细胞是通过使用先前发表的人源基因编辑upCAR-iPSC（Kwon等人，2024年）制备的。iPSCs在无异种成分、无饲养层的情况下分化为NK细胞。分化所需的细胞因子来自PeproTech（美国新泽西州克兰伯里）。野生型iPSC（WT-iPSCs）和upCAR-iPSCs被接种到Spherical Plate 5D（瑞士Erienbach的Kugelmeiers Ltd.）上，以促进三维球体的形成。细胞培养1天后形成球体...

生成和表征通用高效嵌合抗原受体自然杀伤（upCAR-NK）细胞

iPSCs通过阶段特异性细胞因子刺激，在超过50天的时间内逐步分化为NK细胞（图2A）。第50天时，分化的NK细胞显示出特征性的形态和轻微的细胞聚集（图2B）。分化的NK细胞表现为CD45⁺CD56⁺CD3^?，CD16和NKG2D的表达水平均高于70%（图2C, D）。CD56是NK细胞的特征性标志物，CD45是造血细胞的标志物，CD3是T细胞的特异性标志物...

讨论

免疫细胞疗法已成为治疗癌症的有前景的方法，最初的试验主要集中在评估CAR-T细胞在癌症治疗中的应用。然而，T细胞在免疫细胞疗法中的使用与严重的不良反应相关，包括CRS、神经毒性和GvHD（Murthy等人，2019年；Shimabukuro-Vornhagen等人，2018年）。在这方面，NK细胞提供了一个有吸引力的替代方案，因为它们可以被基因工程改造以靶向肿瘤细胞，同时可能降低这些不良反应的风险...

结论

总之，将人源upCAR-NK细胞用于治疗犬类肿瘤是可行的，这可能为开发基于NK细胞的犬类癌症治疗方法提供一种高效且成本节约的策略（图2E）。

CRediT作者贡献声明

Youngjun Kang：撰写——原始稿件、验证、方法学、研究、数据整理、概念化。Ga-Hyun Lim：验证、方法学、研究。Daekee Kwon：撰写——审稿与编辑、验证、方法学、研究。JongYeong Lee：验证、方法学。Bokyung Moon：验证、方法学、研究。Kyung-Sun Kang：监督。Min-Ok Ryu：监督。Kyoung-Won Seo：监督。Hwa-Young Youn：监督、项目管理。

伦理声明

所有参与者或其法定代表均已签署知情同意书，同意参加本研究并发表相关文章。参与者的隐私权得到了保护。

本研究遵循了进行研究所在地区的相关法律、监管框架和指南。该研究已获得首尔国立大学IRB的批准（批准编号：2302/001-004）。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：作者D Kwon、B Moon和KS Kang拥有与本研究相关的专利（专利申请编号1020230134560，申请日期为2023年10月10日）。作者未报告其他利益冲突。

Youngjun Kang|Ga-Hyun Lim|Daekee Kwon|JongYeong Lee|Bokyung Moon|Kyung-Sun Kang|Min-Ok Ryu|Kyoung-Won Seo|Hwa-Young Youn