星形胶质细胞生酮经CPT1A K344位点Kbhb修饰稳定与H3K9bhb表观重编程促进中枢神经系统损伤修复

《Advanced Science》：Astrocytic Ketogenesis Protects Central Nervous System Injury via CPT1A Stabilization and Epigenetic Regulation

　　

中枢神经系统（CNS）损伤后，反应性星形胶质细胞增殖并包裹病灶以促进修复。然而，其具体代谢特征仍不清楚。在此，通过整合单细胞与空间转录组学，研究人员发现脊髓损伤（SCI）后有一群星形胶质细胞发生增强的脂质和酮体代谢重编程。酮体β-羟基丁酸（β-OHB）通过P300介导的赖氨酸β-羟基丁酰化（Kbhb）抑制肉碱棕榈酰转移酶-1A（CPT1A）的自噬性降解。星形胶质细胞特异性缺失Cpt1a导致SCI后伤口愈合受损、轴突保留减少和运动恢复恶化，外源性β-OHB可挽救这些效应。机制上，生酮促进伤口修复和脂质代谢重编程，通过SCI后星形胶质细胞中H3K9bhb（组蛋白H3第9位赖氨酸β-羟基丁酰化）依赖性表观遗传重塑形成正反馈环路。此外，生酮饮食（KD）在多种CNS损伤模型中促进组织修复。临床上，β-OHB水平升高与SCI患者更好的组织保留和功能恢复相关。总之，研究结果强调CNS损伤后星形胶质细胞脂质代谢和表观遗传重编程的关键作用，并确定KD为有前景的治疗策略。

CNS损伤主要包括创伤性脑损伤/脊髓损伤（TBI/SCI）和卒中，是运动、感觉和自主神经功能死亡和永久残疾的主要原因，有效疗法开发受限于对损伤和修复机制认识不足。星形胶质细胞是CNS最丰富的胶质细胞，损伤后发生反应性，围绕创伤、缺血、感染或神经退行性病灶形成保护性边界；传统认为边界阻碍再生，新证据显示病灶处新生成星形胶质细胞限制炎症、构建保护屏障并促进组织修复和功能恢复。但增殖性边界形成星形胶质细胞的基本性质，尤其代谢重编程及其与转录和功能异质性的关系仍不清楚。星形胶质细胞与血管密切，是代谢物运输关键通道，可摄取血糖转化为乳酸供神经元，并反向清除毒性代谢物；CNS脂质含量高，星形胶质细胞可吸收过度活跃神经元脂质以避免脂毒性，导致脂质积累和脂代谢重编程，但CNS损伤后反应性星形胶质细胞是否异常脂代谢及其影响功能与疾病进展仍未知。因此，研究人员整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）与空间转录组学（ST），拟阐明反应性星形胶质细胞细胞和代谢异质性，聚焦脂代谢以识别调控疾病进展靶点；研究发现损伤边界富集脂肪酸和酮体（KB）代谢增强的星形胶质细胞，其通过肉碱棕榈酰转移酶-1A（CPT1A）蛋白稳定和H3K9bhb依赖性表观遗传重编程促进神经元存活、轴突保留和伤口修复，强调星形胶质细胞代谢和表观重编程的关键作用，并将星形胶质细胞生酮定位为促进CNS组织修复的潜在靶点；论文发表于《Advanced Science》。

关键技术方法概括：研究人员再分析公共小鼠脊髓snRNA-seq/scRNA-seq和ST数据集GSE234774与GSE205029，采用Harmony、Seurat、UMAP、RCTD解卷积、scMetabolism、GSEA和AddModuleScore分析代谢与空间特征；用磁激活细胞分选（MACS）分选脊髓星形胶质细胞，结合脂滴染色、透射电子显微镜（TEM）、免疫荧光、Seahorse耗氧率（OCR）/脂肪酸氧化（FAO）和¹³C₁₆-棕榈酸代谢流；采用免疫共沉淀（Co-IP）、Kbhb肽免疫亲和富集LC-MS/MS、Western blot、RT-qPCR和染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）；采用转座酶可及性染色质测序（ATAC-seq）和靶向切割与标记（CUT&Tag）检测H3K9bhb；构建星形胶质细胞特异性Cpt1a条件敲除（CKO）小鼠（Cpt1a^fl/fl×Aldh1l1^CreERT2）和腺相关病毒（AAV）-CPT1A过表达，建立SCI、TBI和大脑中动脉闭塞（MCAO）模型及KD干预，进行行为学、肌电图（EMG）和病理评估；临床纳入南京医科大学第一附属医院急性创伤性颈髓SCI患者脑脊液（CSF）样本、影像和1年随访，对照为无神经疾病的腰麻患者。

研究结果：2.1 Astrocytic Lipid and Ketone Metabolism is Upregulated after SCI：通过再分析snRNA-seq/ST、MACS分选星形胶质细胞的脂滴染色、TEM、免疫荧光、Seahorse OCR/FAO和¹³C₁₆-棕榈酸代谢流，发现SCI后星形胶质细胞脂质和酮体代谢上调，损伤周边富集高PLIN2脂滴星形胶质细胞，FAO增强、基态呼吸和ATP产生增加并促进β-OHB生成；损伤后星形胶质细胞条件培养基改善氧糖剥夺/复氧神经元能量供应、氧化应激、线粒体稳态和存活，生酮抑制剂Hymeglusin可逆转，外源β-OHB具神经保护并促进星形胶质细胞增殖和划痕愈合。2.2 β-OHB Promotes CPT1A Kbhb Modification at Lysine 344 via P300：通过β-OHB检测、Kbhb免疫印迹、免疫沉淀-质谱、Co-IP、P300敲低/过表达、C646（P300抑制剂）和CPT1A赖氨酸突变，发现SCI后β-OHB和全局Kbhb升高，CPT1A为Kbhb修饰蛋白，P300介导CPT1A K344位点Kbhb；阻断该修饰部分逆转β-OHB促进的星形胶质细胞增殖和伤口愈合。2.3 Kbhb Inhibits CPT1A Selective Autophagic Degradation via the Cargo Receptor OPTN：通过放线菌酮（CHX）稳定性、自噬/蛋白酶体抑制剂、Atg5/Becn1/Optn敲低、Co-IP和K344R突变，发现Kbhb以翻译后方式提高CPT1A蛋白稳定性，主要抑制自噬-溶酶体降解；Kbhb减弱CPT1A与LC3及货物受体OPTN结合，Optn敲低阻断Kbhb下调所致CPT1A降解，K344R废除β-OHB对CPT1A-OPTN相互作用和蛋白稳定的作用。2.4 Astrocyte-Specific Deletion of Cpt1a led to Impaired Wound Healing, Reduced Axonal Sparing and Worsened Locomotor Recovery in Mice After SCI, Effects Rescued by Exogenous β-OHB：通过星形胶质细胞特异性Cpt1a CKO小鼠、组织病理、后肢运动学、5-HT⁺轴突、EMG和外源β-OHB，发现CKO导致病灶扩大、CD68⁺细胞浸润增加、神经元存活减少、GFAP⁺SOX9⁺星形胶质细胞增殖和胶质边界受损、损伤周边脂质积累；CKO小鼠运动学、5-HT⁺轴突保留和腓肠肌运动诱发电位（MEP）振幅降低，外源β-OHB可逆转。2.5 Overexpression of CPT1A in Astrocytes Enhanced Tissue Repair after SCI：通过AAV-CPT1A星形胶质细胞过表达，发现CPT1A过表达促进损伤后星形胶质细胞增殖和激活，减少病灶面积、炎症浸润和神经元丢失，促进胶质边界形成，并增强损伤周边星形胶质细胞脂代谢、减少脂质积累。2.6 Astrocytic Ketogenesis Promotes Wound Repair and Lipid Metabolic Reprogramming, Forming a Positive Feedback Loop via H3K9bhb-Dependent Epigenetic remodeling：通过组蛋白Kbhb免疫印迹/免疫荧光、ATAC-seq、CUT&Tag、ChIP-qPCR和RT-qPCR，发现SCI后星形胶质细胞H3K9bhb升高、染色质可及性增加，富集SOX9、STAT3、SOX2和TFE3 motif，H3K9bhb峰富集于伤口愈合、增殖/迁移、脂代谢和三羧酸（TCA）循环；Acat2、Acadl、Acaa1a、Hmgcl、Mki67、Pcna、Myc、Tgfb3启动子H3K9bhb和mRNA升高，Cpt1a CKO降低而β-OHB挽救；阻断H3K9bhb时β-OHB不能挽救CKO表型，CPT1A过表达增强生酮流和H3K9bhb占据，Hym/C646降低全局Kbhb、H3K9bhb和基因mRNA，支持正反馈环路。2.7 The Ketogenic Diet Promotes Tissue Repair after CNS Injury：通过SCI、TBI和MCAO模型2周KD干预，发现KD提高SCI小鼠血酮、损伤组织β-OHB和Kbhb，增加星形胶质细胞CPT1A、SOX9、GFAP表达，减少SCI病灶和CD68⁺浸润、增加神经元存活、增强星形胶质细胞增殖和边界形成、减少脂质积累；TBI减少病灶体积和周边脂质积累并促进神经元存活；MCAO减少梗死体积、减轻缺血边界脂质积累并保护神经元。2.8 High Levels of β-OHB in the CSF of SCI Patients Indicate better Tissue Preservation and Functional Recovery：通过急性SCI患者CSF、影像和1年随访，发现SCI患者CSF β-OHB高于对照；美国脊髓损伤协会（ASIA）A/B完全运动瘫痪患者中高CSF β-OHB者更可能功能改善；CSF β-OHB与MRI T2高信号面积负相关，与弥散张量成像（DTI）各向异性分数（FA）正相关，与CSF胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经丝轻链（NF-L）负相关；多变量回归校正ASIA分级、损伤节段、年龄、性别和采样间隔后仍显著，提示高CSF β-OHB是良好神经预后的生物标志。

讨论部分指出，既往scRNA-seq和多组学开始刻画星形胶质细胞边界分子表达谱，但该区域代谢和表观调控机制不清；本研究证明SCI后损伤边界反应性星形胶质细胞脂代谢增强，并通过协调代谢和表观重编程发挥神经保护；从转化角度，KD促进CNS损伤后伤口修复，支持其作为神经疾病潜在治疗策略。讨论还强调星形胶质细胞反应性已由均一被动反应转变为异质、情境依赖的病理决定因素，边界形成对伤口愈合、限制炎症、血脑屏障恢复和功能恢复必要；代谢通路日益被视为星形胶质细胞反应性调节靶点，星形胶质细胞与神经元在葡萄糖和脂质代谢上耦合，脑内脂质精确调控和清除对避免脂毒性重要；星形胶质细胞可利用FAO合成KB并经单羧酸转运体释放，为神经元供能并可能抗氧化；β-OHB作为Kbhb化学供体，连接代谢与表观遗传。研究局限包括损伤边界星形胶质细胞异质性未完全表征、其他代谢通路对组织修复贡献未充分探索、星形胶质细胞与其他细胞协同信号机制仍不清楚。研究结论可译为：本研究证明SCI后损伤边界反应性星形胶质细胞脂代谢增强，并通过协调的代谢和表观遗传重编程发挥神经保护作用；从转化角度看，KD促进CNS损伤后伤口修复，进一步支持其作为神经疾病中有前景治疗策略的潜力；总之，研究结果强调CNS损伤后星形胶质细胞脂质代谢和表观遗传重编程的关键作用，并确定KD为有前景的治疗策略。