《Journal of Neuroscience Research》：Knockdown of CLEC7A Alleviates Ischemic Brain Injury by an Anti-Inflammatory Microglial Phenotype via the CXCL1/CXCR2 Axis
编辑推荐：
研究人员通过整合分析基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集，鉴定出C型凝集素结构域家族7成员A（C-type lectin domain family 7 member A, CLEC7A）为关键枢纽基因。利用体外氧糖剥
研究人员通过整合分析基因表达综合（Gene Expression Omnibus, GEO）数据集，鉴定出C型凝集素结构域家族7成员A（C-type lectin domain family 7 member A, CLEC7A）为关键枢纽基因。利用体外氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）模型中的BV2小胶质细胞/HT22神经元共培养体系及体内大鼠大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）模型，研究了CLEC7A的功能。研究人员在体外和体内敲低CLEC7A，并通过脑梗死体积和神经行为学评分评估功能结果。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）评估炎症因子水平，通过蛋白质印迹（western blot）、免疫组织化学和免疫荧光检测小胶质细胞极化标志物。采用重组趋化因子（C-X-C基序）配体1（recombinant Chemokine (C-X-C motif) ligand 1, rCXCL1）激动剂进行拯救实验。结果显示，CLEC7A敲低在体内减小了MCAO诱导的脑梗死体积，减轻了脑损伤和神经功能缺损，并在体外提高了细胞活力、减少了细胞凋亡。此外，CLEC7A敲低在体内和体外均抑制了促炎性小胶质细胞表型标志物，同时增强了抗炎性标志物。该保护作用通过细胞因子-细胞因子受体相互作用通路介导，具体通过下调CXCL1/C-X-C基序趋化因子受体2（C-X-C motif chemokine receptor 2, CXCR2）实现，因为重组CXCL1处理可逆转上述保护效应。总之，沉默CLEC7A通过促进抗炎性小胶质细胞表型减轻缺血性脑损伤。靶向CLEC7A以抑制CXCL1/CXCR2轴是减轻神经炎症、改善卒中后恢复的一种有前景的治疗策略。
缺血性脑卒中仍是全球范围内致死和致残的主要原因，现有再灌注治疗（如静脉溶栓和机械取栓）受限于狭窄的治疗时间窗，且无法完全阻止后续的炎症级联反应和继发性脑损伤。小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，在缺血损伤后迅速激活，并极化为促炎性M1表型和抗炎性M2表型。M1型释放肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）等加重神经元死亡和血脑屏障破坏；M2型则促进组织修复和炎症消退。因此，调控小胶质细胞极化方向是减轻卒中后脑损伤的重要策略。CLEC7A（又称Dectin-1）是β-葡聚糖的模式识别受体，以往研究多聚焦于外周巨噬细胞，其在脑内小胶质细胞中的作用近年来开始受到关注。已有研究表明CLEC7A信号可加重实验性卒中后的神经炎症，敲低CLEC7A可抑制小胶质细胞激活和神经元焦亡，但CLEC7A能否驱动小胶质细胞表型转化及其下游分子机制尚不清楚。基于此，本研究通过生物信息学筛选、体外细胞实验和体内动物模型全面验证了CLEC7A在缺血性脑损伤中的功能与机制。
研究人员利用来自GEO数据库的四个大鼠脑组织数据集（训练集GSE78731、GSE61616，验证集GSE97537、GSE106680），经批次效应校正后筛选出86个差异表达基因。通过蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络和三种机器学习算法（最小绝对收缩和选择算子[LASSO]、支持向量机递归特征消除[SVM-RFE]、Boruta算法）取交集，鉴定出CCL2、CLEC7A和ITGAX三个核心基因，并在外部数据集中验证其一致性上调。结合文献调研，最终选择CLEC7A进行功能研究。体外实验中，研究人员在BV2小胶质细胞与HT22神经元共培养体系上建立OGD模型，利用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）敲低CLEC7A；体内实验采用成年雄性Sprague-Dawley大鼠永久性MCAO模型，通过脑内立体定位注射慢病毒载体介导CLEC7A敲低，并设置重组CXCL1（rCXCL1）进行通路拯救实验。研究评估了脑梗死体积、神经行为评分、脑含水量、组织病理学改变、炎症因子水平、小胶质细胞极化标志物及凋亡率等指标。
研究结果显示：3.1 生物信息学分析与差异基因筛选：整合数据集并去除批次效应后，鉴定出86个显著上调的差异表达基因，KEGG和GO富集分析显示其参与自然杀伤细胞介导的细胞毒性、中性粒细胞胞外陷阱形成、白细胞增殖及趋化因子活性等免疫相关通路。3.2 机器学习筛选hub基因：通过LASSO、SVM-RFE和Boruta三种算法取交集，得到CCL2、CLEC7A和ITGAX，并在GSE97537和GSE106680中验证三者均显著上调，表明其具有作为缺血性脑卒中生物标志物的潜力。3.3 CLEC7A敲低在OGD条件下促进抗炎小胶质细胞表型：在BV2/HT22共培养OGD模型中，OGD上调CLEC7A表达；敲低CLEC7A可提高细胞活力、降低凋亡率，抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生。流式细胞术和Western blot显示，CLEC7A敲低降低促炎标志物CD86、iNOS、CD16，并升高抗炎标志物CD206、Arg1、IL-10，免疫荧光染色进一步验证了该表型转化。3.4 CLEC7A敲低减轻大鼠缺血性脑卒中进展：在MCAO大鼠中，慢病毒介导的CLEC7A敲低显著减少TTC染色显示的脑梗死体积，降低脑含水量，改善神经功能缺损评分（neurological deficit score, NDS）和改良Garcia评分；HE和Nissl染色显示皮质组织损伤减轻、神经元存活增加；免疫荧光共定位显示CLEC7A与Iba-1的共表达在梗死周围皮质显著减少。3.5 CLEC7A敲低在体内促进抗炎小胶质细胞表型：MCAO大鼠脑组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和ROS水平升高，CLEC7A敲低显著抑制这些炎症因子；qRT-PCR显示敲低下调M1标志物iNOS和TNF-α，上调M2标志物TGF-β和Arg1；免疫组化和Western blot证实CD86阳性细胞减少，CD206阳性细胞增加，且Iba-1总表达下降。3.6 筛选CLEC7A下游靶通路：将GeneCards数据库中CLEC7A相关基因与鉴定的86个差异表达基因取交集，KEGG富集分析显示细胞因子-细胞因子受体相互作用通路显著富集；进一步验证显示CLEC7A敲低显著下调CXCL1及其受体CXCR2的mRNA和蛋白表达。3.7 体外拯救实验：在OGD+si-CLEC7A组中加入rCXCL1后，CLEC7A敲低对细胞活力的保护作用、抗凋亡作用、抗炎作用和M2极化促进作用均被明显逆转，同时CXCL1和CXCR2蛋白表达恢复。3.8 体内拯救实验：在MCAO大鼠中给予rCXCL1可抵消CLEC7A敲低带来的梗死体积缩小、脑水肿减轻和神经功能改善，HE和Nissl染色亦显示组织保护作用被削弱，CLEC7A/Iba-1共定位信号回升。3.9 体内极化拯救实验：rCXCL1逆转了CLEC7A敲低对TNF-α、IL-1β、IL-6和ROS的抑制效应，同时恢复了iNOS高表达、降低了Arg1，免疫组化显示CD86阳性细胞增加而CD206阳性细胞减少，Western blot证实CXCL1、CXCR2和Iba-1蛋白水平回升。
讨论部分指出，本研究通过多步骤筛选策略稳健地鉴定出CLEC7A为缺血性卒中的核心hub基因，并在独立外部队列中验证了其病理相关性。体内外实验一致表明，敲低CLEC7A可显著减轻脑损伤，其核心机制是促进小胶质细胞由促炎M1表型向抗炎M2表型转化。这一转化依赖下调CXCL1/CXCR2轴，因为给予rCXCL1可消除上述保护作用。研究同时承认永久性MCAO模型与临床部分再灌注情况存在差异，未来需采用短暂性MCAO模型和更长观察周期加以验证。
研究结论：研究人员通过整合生物信息学和机器学习分析将CLEC7A鉴定为关键枢纽基因，敲低CLEC7A通过抑制CXCL1/CXCR2信号通路驱动小胶质细胞向抗炎表型转化，从而减轻缺血性脑损伤、减小梗死体积并改善功能恢复。CLEC7A/CXCL1轴有望成为缺血性脑卒中治疗的新型靶点，未来应开发特异性药理学抑制剂或单克隆抗体，并在更高级动物模型和多靶点策略中验证其转化价值。
