月经周期对女性生殖道及循环CD8+ T细胞表型的影响：一项横断面研究

《American Journal of Reproductive Immunology》：Genital Tract and Circulating CD8+ T Cell Phenotypes Vary Across the Menstrual Cycle

　　

问题：月经周期包含两个主要阶段：卵泡期（follicular phase），以雌二醇（estradiol）升高和孕酮（progesterone）水平低为特征；以及黄体期（luteal phase），以排卵后孕酮水平升高为标志。性激素的变化具有深远的生理效应，但其对免疫的影响仍知之甚少。主流理论认为，黄体期免疫功能的降低有利于胚胎着床，但同时也增加了对感染的易感性。因此，明确月经周期对生殖道及全身免疫的影响，对于理解不同部位免疫如何受到影响至关重要。 研究方法：研究人员利用流式细胞术（flow cytometry）检测了58名卵泡期女性和20名黄体期女性的宫颈外口（ectocervical）和阴道组织活检及血液样本中T细胞的表型差异，并测定了血清和宫颈阴道分泌物（cervicovaginal secretions）中71种细胞因子和趋化因子（cytokines and chemokines）。 结果：CD8+ 记忆性T细胞亚群的比例随月经周期阶段而变化，黄体期中央记忆性T细胞（central memory cells）频率较高，而卵泡期终末分化效应记忆性T细胞（TEMRA）较多。黄体期宫颈CD8+ T细胞表现出更高的CD38和CD39表达频率。研究人员发现，卵泡期宫颈阴道液中CCL15和IL-2浓度较高，血清中CXCL12浓度较高；黄体期宫颈阴道分泌物中CXCL13浓度较高。 结论：研究结果揭示了月经周期阶段如何调节生殖道CD8+ T细胞表型和记忆性亚群在整个周期中的变化，并可能影响不同组织部位的免疫，进而影响局部感染的易感性。

论文解读

一、研究背景与意义

女性生殖道（female genital tract, FGT）是性传播感染（sexually transmitted infections, STIs）的重要门户。月经周期由卵泡期和黄体期两个主要阶段组成：卵泡期以雌二醇升高和孕酮水平低为特征，黄体期则以排卵后孕酮水平急剧升高为标志。除调节生殖生理外，雌二醇和孕酮还能改变免疫应答。既往研究提出，黄体期孕酮水平升高可能造成免疫抑制，形成所谓的“易感窗口”（window of vulnerability），增加对STIs的易感性。然而，不同STI在月经周期中的易感性变化并不一致：淋病奈瑟菌培养阳性率和HIV、HSV-2病毒脱落率在低孕酮的卵泡期更常见，而沙眼衣原体则在黄体期检出率更高。这种复杂性表明，自然激素变化对阴道环境、局部免疫应答和STI易感性的影响尚待阐明。

尽管CD4⁺ T细胞因其作为HIV感染靶细胞而受到广泛关注，但对激素波动如何影响CD8⁺ T细胞的了解仍然有限。CD8⁺ T细胞通过细胞毒功能靶向杀伤感染细胞，是黏膜免疫对抗胞内病原体的重要介质，在下生殖道上皮内淋巴细胞中占有相当比例。既往研究显示，子宫内膜组织中的CD8⁺ T细胞在黄体期丧失细胞溶解功能，而阴道或宫颈外口组织中的CD8⁺ T细胞则未观察到这种差异。体外实验表明，雌二醇或TGFβ可直接抑制子宫CD8⁺ T细胞的细胞毒功能，孕酮则通过上皮细胞分泌TGFβ间接发挥抑制作用。然而，关于月经周期性激素波动对CD8⁺ T细胞功能和表型直接下游效应的报道存在矛盾，尤其是在下生殖道（宫颈外口和阴道）中。因此，进一步表征月经周期中局部FGT和全身T细胞应答，对于理解STI易感性的机制和确定疫苗保护的相关因素至关重要。

二、研究设计与方法

本研究样本来自Kinga研究（Clinicaltrials.gov ID# NCT03701802）的亚组参与者，该研究于2018年10月至2019年12月招募了406对肯尼亚异性伴侣。纳入本报告的样本来自非妊娠、HIV未感染、未使用激素避孕且无闭经（距末次月经超过35天）的参与者。每位参与者提供了阴道组织（VT）活检、宫颈（CX）活检和PBMC样本用于流式细胞术分析，宫颈阴道液（CVT）通过月经杯（Softcup）收集，与血清样本一起用于可溶性免疫因子分析。

关键技术方法包括：高参数流式细胞术（high-parameter flow cytometry），使用BD FACSymphony A5细胞仪采集样本，FlowJo软件分析，以25个细胞为下游门控的最低要求；多重Luminex平台检测（71-Plex Panel），用于定量血清和宫颈阴道分泌物中的细胞因子和趋化因子。统计分析采用基于秩的回归（rank-based regression）比较T细胞表型百分比，线性回归比较log10转换的细胞因子/趋化因子浓度，逻辑回归分析二分法编码的检出情况。CVT免疫学分析针对细菌性阴道病（BV）状态、HSV-2血清学、HIV暴露和精液暴露进行先验调整。

三、研究结果

3.1 研究人群与样本采集：78名女性的样本被分类为卵泡期（58人）或黄体期（20人）。研究人群较年轻（46%在30岁以下）、性活跃（过去一个月中位8次无保护阴道性交），38% HSV-2血清阳性，14% Nugent评分7-10分的细菌性阴道病阳性，18%有HIV感染的性伴侣。

3.2 月经周期不影响生殖道组织或循环中的T细胞亚群频率：下FGT中大多数CD45⁺淋巴细胞为CD3e⁺ T细胞，且CX、VT和PBMC中CD3e⁺ T细胞频率在月经周期各阶段无差异。CD8⁺ T细胞、CD4⁺ Tconv和Treg的频率在各样本类型中均未观察到显著差异。

3.3 月经周期与CD4⁺ Tconv记忆亚群或活化表型的改变无关：阴道组织中CCR5在Tconv上的表达（约80%）高于宫颈组织（约65%），但卵泡期与黄体期之间无显著差异。CVT活检中大多数CD4⁺ Tconv为CCR7^- CD45RA^- 效应记忆细胞，各记忆亚群（TN、TCM、TEMRA、TEM）频率在CX、VT或PBMC中均无显著的周期阶段差异。CD69和CD103的组织驻留标志物表达也无明显差异。

3.4 月经周期与独特的CD8⁺ T细胞记忆和组织驻留亚群相关：大多数FGT CD8⁺ T细胞表现为组织驻留记忆（Trm）表型（CD103⁺ CD69⁺），VT活检中Trm频率最高（中位数60%-70%）。卵泡期VT中CD103^- CD69⁺ CD8⁺ T细胞频率显著高于黄体期（中位数12% vs 7%，p=0.049）。黄体期CX和PBMC中CD8⁺ CCR7⁺ CD45RA^- TCM频率显著升高（CX中位数7% vs 13%，p=0.0011；PBMC中位数8% vs 11.5%，p=0.0161）；相反，卵泡期CX中CD8⁺ CCR7^- CD45RA⁺ TEMRA频率显著升高（中位数25% vs 19%，p=0.0347）。

3.5 黄体期生殖道CD8⁺ T细胞表达更高频率的活化状态和代谢调节标志物：黄体期CX CD8⁺ T细胞中CD39（中位数6% vs 10%，p=0.0208）、CD38（中位数6.9% vs 10.6%，p=0.0026）以及CD38与HLA-DR共表达（中位数3.1% vs 5.4%，p=0.0018）的频率均显著高于卵泡期。

3.6 卵泡期宫颈阴道分泌物中T细胞相关细胞因子和组织归巢趋化因子检出率更高：软杯样本中，卵泡期IL-2和MIP-1δ/CCL15的log10转换浓度显著升高，而黄体期BCA-1/CXCL13升高。SDF-1α/β/CXCL12在卵泡期软杯样本中检出频率更高。血清样本中仅SDF-1α/β/CXCL12在卵泡期浓度显著升高。

四、讨论与结论

本研究提供了月经周期阶段对循环和下FGT中CD8⁺ T细胞表型和记忆亚群影响的新见解。数据表明，月经周期并不显著影响宫颈、阴道或PBMC中T细胞亚群（CD8、CD4⁺ Tconv、Treg）的频率。与既往部分研究不同，本研究未观察到CCR5⁺ CD4⁺ Tconv频率在周期阶段间的显著差异，这可能与采样方法（组织活检vs宫颈刷/灌洗液）和周期时间点划分的差异有关。

CD8⁺ T细胞记忆群体在宫颈而非阴道活检中表现出周期变化：卵泡期宫颈CCR7^- CD45RA⁺ TEMRA频率增加，黄体期宫颈和PBMC中CCR7⁺ CD45RA^- TCM相应增加。TCM是长寿记忆T细胞，持续在体内循环至次级淋巴器官，具有高增殖能力；TEMRA增殖能力降低但效应功能快速，高度活化。这种TCM与TEMRA频率的互换支持卵泡期免疫活化增强而黄体期炎症减弱的理论。

黄体期宫颈CD8⁺ T细胞中CD39、CD38及CD38/HLA-DR共表达频率显著升高。CD39将细胞外三磷酸腺苷（ATP）降解为一磷酸腺苷（AMP），CD38将细胞外烟酰胺腺嘌呤二核苷酸降解为AMP，两者均可通过CD73进一步降解为免疫抑制性腺苷（ADO），同时减少可作为促炎损伤相关分子模式（DAMP）的细胞外ATP。因此，黄体期CD38和CD39的升高可能创造更具免疫抑制性的微环境。CD38表达与外周T细胞HIV疾病进展相关，CD39则与慢性抗原-TCR刺激和终末耗竭相关。研究人员提出，黄体期宫颈CD8⁺ T细胞中CD38和CD39的表达增加，提示月经周期后半段存在增强的免疫抑制或免疫代谢自身调节。

可溶性免疫因子方面，卵泡期检测到与T细胞募集、免疫活化和抗微生物效应相关的细胞因子和趋化因子显著增加。IL-2在组织内CD8⁺ T细胞中的高浓度或延长信号促进终末效应分化，与卵泡期CX活检中TEMRA频率增加一致。CCL15参与T细胞、NK细胞和髓系细胞募集，具有直接抗菌特性。CXCL12作为CXCR4配体，可通过直接结合并内化CXCR4阻断病毒进入CXCR4⁺ 靶细胞。黄体期阴道分泌物中CXCL13升高与既往子宫内膜活检研究结果一致，CXCL13参与滋养层迁移和囊胚成功着床。

研究局限性包括：组织活检体积小且大小不一，细胞活力可变，无法捕获更稀有的T细胞亚群；未评估其他免疫细胞类型（B细胞、NK细胞、抗原呈递细胞）；缺乏同一女性卵泡期和黄体期的配对样本；为探索性横断面分析，未进行事后多重比较校正。

结论：本研究利用高参数流式细胞术和多重Luminex蛋白检测，横断面评估了月经周期阶段对宫颈和阴道组织活检及血液中T细胞记忆和表型标志物表达的影响。几乎所有与月经周期阶段相关的标志物表达差异均见于宫颈阴道组织活检中的CD8⁺ T细胞，表明雌二醇和孕酮的波动与组织驻留和记忆亚群的局部变化相关。尽管未观察到CD4⁺ Tconv标志物表达的显著差异，但黄体期宫颈CD8⁺ T细胞中与局部代谢调节和免疫抑制相关的标志物表达增加。总体而言，研究结果有助于理解月经周期阶段对人类CD8⁺ T细胞表型标志物表达和阶段相关细胞因子/趋化因子谱的影响。