基于混合机理模型的哺乳动物细胞培养乳酸逃逸与回补代谢捕获方法

《Biotechnology and Bioengineering》：A Hybrid Mechanistic Model Capturing Lactate Run-Away and Back-Metabolism in Mammalian Cell Culture

机械建模在生物制药制造中具有重要意义，能够实现计算机模拟实验。然而，由于潜在生物过程的复杂性，开发稳健的哺乳动物细胞培养机理模型仍具挑战性。现有数据驱动模型通常外推能力有限，且需要大量数据集。并非所有建模方法都能准确表征不同的代谢情景，如乳酸消耗和产生。为解决这些限制，本研究提出了一种用于哺乳动物细胞培养的混合机理模型，以提高预测精度和过程理解。该模型整合了来自10次运行（7 L）的高频pH数据与低频测量值，包括活细胞密度（VCD）、葡萄糖、乳酸和单克隆抗体（mAb）浓度。研究人员首次开发了考虑两种情景的细胞生长与死亡以及乳酸代谢的新型动力学方程。此外，该模型基于时间序列pH和补料数据实现了自动乳酸代谢开关检测。模型表现出高预测能力，在训练批次中对VCD、mAb、葡萄糖和乳酸浓度的平均决定系数R2为0.88。实时微调进一步提高了精度，使葡萄糖的均方根误差（RMSE）降低约50%，乳酸的RMSE降低约30%。结果表明，该模型能在可变生物加工条件下对VCD、mAb、葡萄糖和乳酸浓度提供准确的实时预测。

一、研究背景、现存问题与研究意义

哺乳动物细胞培养，特别是使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行重组蛋白治疗药物如单克隆抗体（mAb）的生产，是现代生物制药制造的基石。过程优化对于确保产品质量和高产量至关重要。在复杂生物过程和动态生物系统的建模中，主要有三类方法：机理模型、数据驱动模型和混合模型。机理模型基于物理、化学和生物学的基本定律，具有良好的可解释性和外推能力，但其开发和校准需要广泛的过程知识，且在关键机制未知或过度简化时预测可靠性受限，尤其是乳酸产生与消耗阶段之间的转换仍是持久建模难题。数据驱动模型依赖统计或机器学习方法，能捕捉非线性动态和复杂交互，但通常需要大量高质量数据，易过拟合，且缺乏物理和生物学可解释性。混合模型结合了机理框架的可解释性和外推能力与数据驱动方法的适应性，但仍主要基于质量平衡方程，缺乏基本的动力学理解。为克服这些局限，研究人员提出了一个混合机理建模框架，动态整合机理理解与实时数据，旨在提高对关键过程变量（如VCD、葡萄糖、乳酸和mAb滴度）的预测准确性，并实现对乳酸代谢转换这一关键特征的精确捕捉，这对于描述培养代谢、支持培养持久性和产品质量具有重要意义。

二、研究采用的关键技术方法

研究人员利用实验室规模的7 L生物反应器（Applikon Biotechnology），进行了10批次的CHO细胞流加培养实验，其中5批用于训练，4批用于测试，1批用于评估乳酸逃逸情景。模型整合了高频在线数据（每30秒采样的pH值和多种补料流速）与低频离线数据（每日采样的VCD、葡萄糖、乳酸和mAb浓度）。关键技术方法包括：（1）基于修正的Gompertz函数建立了描述CHO细胞生长和死亡的新动力学方程；（2）提出了新的乳酸产生和消耗动力学方程，并通过累积pH误差和Heaviside阶跃函数来表征乳酸代谢开关；（3）开发了一个基于平滑后pH信号一阶导数的乳酸开关检测算法，用于客观识别代谢转换时间点；（4）采用了基于变异系数的选择性参数实时微调策略，仅对高变异性参数（如细胞产率系数Y_X/GLC）进行重参数化。模型使用Python语言编程，采用LSODA积分方法和Nelder-Mead优化方法求解常微分方程组。

三、研究结果

3.1 乳酸开关时间的确定

研究人员通过计算平滑后时间序列pH的一阶导数，设定阈值为0.05来识别乳酸开关时间。在10批实验中，8批表现出乳酸回补代谢的批次其乳酸开关时间一致出现在约第5天（范围4.84至5.09天），而2批乳酸逃逸批次则未检测到开关。该算法检测到的平均开关时间为4.96天，与基于插值乳酸曲线得到的4.66天相比，平均差异仅为0.30天，验证了算法的准确性。

3.2 动力学参数的确定

基于5批乳酸回补代谢训练批次的数据，研究人员获得了各动力学参数的均值、标准差和变异系数。结果显示，与葡萄糖消耗和乳酸代谢直接相关的参数（如Y_X/GLC和Y_X/LAC）变异系数较高（大于0.4），表明这些参数对生物加工条件更为敏感，因此成为实时微调的重点对象。而细胞生长、死亡和mAb生产相关参数的稳定性较好。

3.3 训练数据集中的模型性能

在包含乳酸回补和乳酸逃逸的训练批次中，模型模拟值与实验测量值高度吻合。模型成功捕捉了两种乳酸代谢情景，而传统文献模型通常无法捕捉乳酸回补。在所有训练批次中，模型对VCD、mAb、葡萄糖和乳酸浓度的平均决定系数R²达到0.88，其中VCD和mAb的R²分别高达0.97和0.98。

3.4 敏感性分析

通过单因素敏感性分析，研究人员发现参数μ_max,growth、Y_X/GLC和m_glc对葡萄糖、乳酸、VCD和mAb浓度均有显著影响；Y_X/GLC对葡萄糖影响最大；Y_mAb/X对mAb影响显著；而Y_X/LAC和C_pH对乳酸浓度影响较大。

3.5 测试数据集的实时预测

在4批外部测试批次中，研究人员将训练所得的低变异参数直接应用，并利用前8天的实时葡萄糖和乳酸数据对高变异参数Y_X/GLC进行微调。结果表明，无微调模型在前8天预测良好，但在8至14天后偏离；而微调后的模型预测与实验数据一致性显著提升。具体而言，微调使葡萄糖的R²从负值提升至0.68，乳酸R²从0.65提升至0.84；葡萄糖的均方根误差（RMSE）降低了约50%（从1.59降至0.77 g/L），乳酸RMSE降低了约30%（从1.05降至0.72 g/L）。同时，模型对VCD和mAb的预测无需微调即表现出色（R²分别为0.96和0.94），证明了模型良好的泛化能力。

四、总结与讨论

讨论部分： 研究中观察到的乳酸代谢开关可能反映了从糖酵解溢流代谢向氧化碳利用增加的转变。在培养早期，高葡萄糖利用率导致丙酮酸生成超过线粒体氧化能力，丙酮酸被还原为乳酸以维持NAD⁺再生。而在培养后期，糖酵解压力降低和线粒体氧化增强有利于乳酸摄取并进入三羧酸循环。虽然模型表现出高预测精度，但它严重依赖高质量的pH数据，信号噪声或探头漂移可能触发假阳性。未来可开发专门的异常检测算法来处理意外操作事件。

研究结论： 本研究开发了一种能够捕获乳酸逃逸和乳酸回补的混合机理模型，用于哺乳动物细胞培养系统。来自10批生物反应器的在线和离线数据集被用于模型训练和测试。本研究首次引入了CHO细胞生长和死亡率以及乳酸产生和消耗的新型方程。此外，首次实现并验证了能够准确识别乳酸开关时间和乳酸回补存在的乳酸开关检测算法。模型通过五批乳酸回补和一批乳酸逃逸的代表性运行进行校准以优化动力学参数，并在另外四批运行中评估了其实时预测性能，结果显示出对乳酸回补和逃逸动态的出色预测精度。从工艺开发角度看，乳酸回补对过程控制、过程分析技术和工业部署具有重要意义。总体而言，该混合机理模型有效预测了单克隆抗体、代谢物和活细胞的浓度分布，同时通过基于pH的监测实现了对乳酸积累的早期检测，展示了混合机理框架支持智能化和自动化生物制造的潜力。本研究的局限性在于模型验证仅限于VCD、葡萄糖、乳酸和mAb滴度，未来工作将在获得足够丰富数据集时扩展到氨基酸消耗、氨积累、渗透压动态和产品质量属性等方面。