Mn@GaMOF协同调控滑膜ROS–NO–RNS网络抑制成纤维样滑膜细胞焦亡并缓解骨关节炎进展

《Redox Biology》：Modulating the Synovial ROS–NO–RNS Network Attenuates Fibroblast-Like Synoviocyte Pyroptosis and Osteoarthritis Progression

　　

骨关节炎（OA）滑膜呈现与成纤维样滑膜细胞（FLS）焦亡（pyroptosis）相关的活性氧（ROS）–一氧化氮（NO）–活性氮（RNS）网络耦合失调；协同氧化还原控制可减弱NLRP3/caspase-1/消皮素D（GSDMD）相关焦亡；调控焦亡性FLS可维持软骨细胞稳态并限制衰老；靶向ROS–NO–RNS轴可减轻滑膜炎（synovitis）和结构性OA进展。

研究背景与意义：骨关节炎（OA）是最常见的关节炎类型，是以进行性软骨退变、滑膜炎、软骨下骨重塑、骨赘形成及疼痛相关功能障碍为特征的全关节疾病。滑膜持续激活可放大局部炎症并产生炎症和分解代谢介质，加速软骨退变。硝化氧化应激是OA滑膜微环境的重要病理特征，涉及活性氧（ROS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）来源一氧化氮（NO）及活性氮（RNS）的耦合失调；成纤维样滑膜细胞（FLS）是滑膜衬里主要细胞和OA滑膜炎关键介导者，NLRP3/caspase-1/消皮素D（GSDMD）相关焦亡可释放白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-18，损害软骨细胞稳态。现有研究对ROS、iNOS来源NO及下游RNS的协同调控不足，单一针对ROS的策略可能难以充分纠正耦合的硝化氧化应激。研究人员开发了经合成后Mn金属化的镓基金属有机框架Mn@GaMOF，用于协调调控滑膜ROS–NO–RNS网络，并研究其是否减轻FLS焦亡和OA进展。研究结论支持Mn@GaMOF增强超氧化物歧化酶（SOD）样、过氧化氢酶（CAT）样及过氧亚硝酸盐（ONOO^?）清除活性，同时GaMOF框架抑制iNOS/NO信号，减轻巨噬细胞和FLS硝化氧化应激，抑制FLS焦亡并保护软骨细胞，在去稳定内侧半月板（DMM）小鼠中改善疼痛相关行为和结构退变。该研究发表于《Redox Biology》，为同时针对OA微环境氧化和硝化组分的氧化还原导向干预提供了依据。

关键技术与方法：临床样本来自上海交通大学医学院附属第九人民医院，OA组为行全膝关节置换术（TKA）的膝OA患者，对照组为无OA临床或影像学证据的关节镜手术患者；并分析GEO数据库GSE12021、GSE55457、GSE55235和GSE206848滑膜样本。材料表征采用透射电子显微镜（TEM）、高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）、扫描透射电子显微镜-能量色散X射线光谱（STEM-EDS）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）、电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）和动态光散射（DLS）；活性评价采用SOD样、CAT样、ONOO^?清除实验及电子自旋共振（ESR）；细胞实验采用RAW264.7巨噬细胞、原代FLS和原代软骨细胞，结合RNA测序（RNA-seq）、流式细胞术、蛋白质印迹（WB）、免疫荧光（IF）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）；体内采用DMM小鼠模型，行行为与步态、micro-CT、组织学、IF及电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析。

主要研究结果：

3.1 OA Synovium Exhibits Inflammatory Activation and Nitro-Oxidative Stress（OA滑膜表现出炎症激活与硝化氧化应激）：通过人OA滑膜与滑液、四个GEO滑膜数据集及DMM小鼠研究，发现OA滑膜衬里增生、炎症细胞浸润和滑膜炎评分升高，iNOS表达、3-硝基酪氨酸（3-NT）积累及滑液亚硝酸盐升高；DMM小鼠出现软骨退变、滑膜炎和滑膜3-NT增加。

3.2 Structural Characterization of Mn@GaMOF（Mn@GaMOF的结构表征）：通过TEM、STEM-EDS、HAADF-STEM、XPS、XRD、ICP-OES和DLS表征，显示Mn@GaMOF为互联球形纳米颗粒，Ga、Mn、O分布均匀，Mn高度分散，Mn²⁺与Mn⁴⁺共存，Ga主要为Ga³⁺，Mn掺入后整体GaMOF纳米结构保持，短时胶体稳定性可接受。

3.3 Mn-Site Engineering Enhances the ROS- and RNS-Regulating Activities of GaMOF（Mn位点工程增强GaMOF的ROS和RNS调控活性）：通过O₂^•?相关显色、WST-1、ESR、ONOO^?清除及H₂O₂分解/O₂生成实验，发现Mn@GaMOF较GaMOF具有更强的SOD样、CAT样和ONOO^?清除活性。

3.4 In Vitro Biocompatibility of Mn@GaMOF（Mn@GaMOF的体外生物相容性）：通过CCK-8、Calcein-AM/PI活死染色和溶血实验，发现浓度不超过50 μg mL^?1时细胞活力较高且溶血低，故后续体外实验采用50 μg mL^?1。

3.5 Mn@GaMOF Attenuates Nitro-Oxidative Stress and Modulates Macrophage Phenotypic Markers（Mn@GaMOF减轻硝化氧化应激并调节巨噬细胞表型标志）：通过LPS刺激RAW264.7细胞，结合荧光探针、Griess、ELISA、RT-qPCR、IF、WB和流式分析，发现Mn@GaMOF降低细胞内NO、ROS、RNS及亚硝酸盐，减少肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-1β分泌，降低M1相关标志并增加部分M2相关标志。

3.6 Mn@GaMOF Attenuates Nitro-Oxidative Stress and Pathogenic Activation in IL-1β-Stimulated FLSs（Mn@GaMOF减轻IL-1β刺激FLS的硝化氧化应激和致病激活）：通过IL-1β刺激原代FLS，结合荧光探针、Griess、ELISA、RT-qPCR、IF和划痕实验，发现Mn@GaMOF降低NO、ROS、RNS、亚硝酸盐、IL-6、CCL2/MCP-1、环氧合酶-2（COX-2）、基质金属蛋白酶13（MMP13）及伤口闭合；1400W和Tempol干预支持NO和ROS参与ONOO^?相关信号。

3.7 Mn@GaMOF Modulates Inflammatory Transcriptional Programs and Suppresses NLRP3/caspase-1/GSDMD-Associated Pyroptosis in FLSs（Mn@GaMOF调节炎症转录程序并抑制FLS中NLRP3/caspase-1/GSDMD相关焦亡）：通过RNA-seq及LPS+ATP刺激FLS，结合形态学、TEM、caspase-1活性、乳酸脱氢酶（LDH）、ELISA和WB，发现Mn@GaMOF调节炎症和应激相关转录程序，降低caspase-1活性、LDH释放、IL-1β/IL-18及NLRP3、N-GSDMD、cleaved caspase-1水平并部分恢复GSDMD-FL；SIN-1部分逆转其作用，Tempol和FeTPPS降低NLRP3/cleaved caspase-1，VX-765降低LDH，OA滑液刺激下Mn@GaMOF降低NLRP3和MMP13。

3.8 Conditioned Media from Mn@GaMOF-Treated FLSs Attenuate Chondrocyte Degeneration and Senescence（Mn@GaMOF处理FLS的条件培养基减轻软骨细胞退变和衰老）：通过FLS条件培养基处理原代软骨细胞，结合Alcian Blue、Toluidine Blue、IF、EdU、SA-β-gal、RT-qPCR和WB，发现Mn@GaMOF处理FLS的条件培养基改善软骨基质沉积、SOX9和COL2A1表达及增殖，降低MMP3、MMP13和p16^INK4a及衰老；MCC950、VX-765及IL-1β/IL-18阻断部分重现保护，重组IL-1β/IL-18回补部分逆转保护。

3.9 Mn@GaMOF Alleviates Pain-Related Behaviors and Joint Degeneration in DMM-Induced OA Mice（Mn@GaMOF减轻DMM诱导OA小鼠疼痛相关行为和关节退变）：通过DMM小鼠关节内给药，结合von Frey、热板、CatWalk、X线、micro-CT、组织学和IF，发现Mn@GaMOF改善机械和热痛阈值及步态参数，减少骨赘、软骨下骨改变、软骨退变、滑膜炎、滑膜3-NT和NLRP3、cleaved caspase-1阳性细胞及软骨MMP13，且未见明显系统毒性。

讨论与结论：讨论认为OA滑膜病理与ROS–NO–RNS网络协同紊乱相关，而非单纯ROS蓄积；Mn@GaMOF中高度分散的混合价Mn位点增强ROS/RNS调控活性，GaMOF框架抑制iNOS相关NO产生，构成互补调控。其作用伴随巨噬细胞炎症表型标志改变、FLS炎症和分解代谢反应降低及NLRP3/caspase-1/GSDMD相关焦亡受抑；条件培养基和药理干预支持焦亡相关旁分泌信号参与FLS–软骨细胞通讯。体内结果支持滑膜硝化应激和NLRP3/caspase-1相关信号降低与关节病理改善相关。讨论同时指出局限：SIN-1等干预不能解析ROS、NO和ONOO^?的相对层级；荧光探针、亚硝酸盐、CBA和3-NT多为间接或探针依赖指标；其他炎症、分解代谢和氧化还原敏感介质可能参与；人样本来自终末期OA；DMM研究小鼠数量有限且以短期疗效为主；材料降解、Mn/Ga释放、长期生物分布和慢性安全性尚待确定。研究结论部分翻译：总之，本研究支持OA滑膜病理与ROS–NO–RNS网络协同紊乱相关，而非孤立ROS蓄积；Mn@GaMOF通过增强ROS/RNS调控活性并抑制过量iNOS相关NO产生，减轻巨噬细胞和FLS硝化氧化应激，并伴随炎症激活和FLS焦亡降低。SIN-1、Tempol和FeTPPS干预支持硝化氧化应激与NLRP3/caspase-1相关焦亡信号之间的贡献性联系；MCC950和VX-765抑制、IL-1β/IL-18阻断及重组细胞因子回补共同支持焦亡相关旁分泌信号在FLS介导软骨细胞功能障碍中的作用。这些变化与实验性OA滑膜和软骨病理改善相关。研究结果将相互关联的ROS–NO–RNS网络定位为具有治疗相关性的氧化还原轴，并为同时针对OA微环境氧化和硝化组分的氧化还原干预提供依据。