ABCG 转运蛋白参与水稻飞虱吡虫啉抗性：功能验证、结构洞察与转录调控

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：ABCG transporters contribute to imidacloprid resistance in Nilaparvata lugens: Functional validation, structural insights, and transcriptional regulation

　　

# 摘要

ATP结合盒（ABC）转运蛋白越来越多地被认识到在杀虫剂抗性中发挥作用，但其在褐飞虱（Nilaparvata lugens）吡虫啉抗性中的具体角色尚不清楚。本文利用敏感品系和抗性达402.61倍的吡虫啉抗性品系，系统表征了ABC转运蛋白的功能、结构和转录调控。维拉帕米在抗性品系中对吡虫啉毒性产生协同作用（协同比2.38），证实了ABC转运蛋白的参与。对32个ABC基因的表达谱分析发现，抗性品系中有20个基因上调，其中ABCG亚家族最为突出。通过RNAi敲低ABCG3或ABCG4后，处理后48小时的吡虫啉诱导死亡率从对照组的50%分别升高至78.33%和61.67%，表明这两种转运蛋白均对吡虫啉抗性有贡献。分子对接和动力学模拟预测，吡虫啉可稳定结合于ABCG3同源二聚体腔道入口，计算结合自由能为?32.32 kcal/mol。四个残基（Leu558、Lys670、Lys484和Ser559）预测形成氢键或极性接触以稳定该复合物，但仍需直接转运实验来确认底物识别。转录分析显示，AhR/ARNT敲低降低了ABCG3和ABCG4的表达，而CncC/MafK敲低则特异性下调ABCG3。双荧光素酶报告基因实验表明，两种转录因子复合物均可反式激活ABCG3启动子，分别增强2.15倍和2.42倍。综上所述，这些发现确认ABCG3和ABCG4是褐飞虱吡虫啉抗性的贡献因子，并将AhR/ARNT和CncC/MafK通路纳入ABCG3表达的调控网络，推进了对Ⅲ相解毒网络的理解，并为抗性管理提供了潜在的靶标。

# 引言

褐飞虱（Nilaparvata lugens，St?l）是亚洲最具破坏性的水稻害虫之一，通过直接取食和传播病毒造成大量产量损失（Wu et al., 2020）。化学防治仍是主要的管理策略，但杀虫剂的广泛和反复使用已导致对多类杀虫剂的高水平抗性（Ye et al., 2024）。其中，对以烟碱型乙酰胆碱受体为靶标的新型烟碱类杀虫剂——吡虫啉的抗性尤为突出且难以应对（Park et al., 2026）。尽管中国已禁止将吡虫啉用于褐飞虱防治，但其对稻纵卷叶螟（Sogatella furcifera）和灰飞虱（Laodelphax striatellus）等水稻害虫的持续使用仍维持了褐飞虱田间种群的高抗性水平（Kang et al., 2026; Teng et al., 2025）。因此，阐明该害虫吡虫啉抗性的基础具有重大的科学意义，并为理解其他半翅目害虫的杀虫剂抗性进化提供了有价值的参考。

已有大量研究致力于阐明褐飞虱吡虫啉抗性的机制。靶标抗性方面，烟碱型乙酰胆碱受体亚基的突变（nAChRα1的Y151S突变）已被充分证实（Liu et al., 2005）。此外，由Ⅰ相和Ⅱ相解毒酶介导的代谢抗性也起着关键作用。具体而言，细胞色素P450单加氧酶（P450s）、谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）和UDP-糖苷转移酶（UGTs）已被证明参与吡虫啉的代谢解毒（Yang et al., 2020; Zhang et al., 2016a）。多个P450基因（如CYP6ER1和CYP6AY1）和UGT基因（如UGT386B2）在抗性品系中过表达，并通过功能实验证实其可代谢吡虫啉（Deng et al., 2024; Zhang et al., 2016b）。这些发现凸显了褐飞虱吡虫啉抗性机制的复杂性，也表明需要持续深入的调查研究。

代谢抗性介导的杀虫剂解毒是一个高度协调的多步骤系统，通常经历三个阶段（Amezian et al., 2021; Hawkins et al., 2019）。在Ⅰ相，细胞色素P450和酯酶等酶引入或暴露官能团（Li et al., 2026; Nauen et al., 2022）。在Ⅱ相，活化后的代谢物由转移酶（包括UGTs和GSTs）与内源性分子（葡萄糖、谷胱甘肽或氨基酸）进行共轭结合（Koirala et al., 2022; Yang et al., 2023）。在Ⅲ相，共轭代谢物或某些情况下母体化合物本身被ATP结合盒（ABC）转运蛋白主动转运出细胞，从而防止细胞内积累和潜在毒性（Amezian et al., 2024）。迄今为止，昆虫代谢抗性研究主要聚焦于Ⅰ相和Ⅱ相解毒酶，其在赋予各类杀虫剂抗性中的作用已被广泛表征（Deng et al., 2026c; Duarte et al., 2022）。相比之下，Ⅲ相ABC转运蛋白对杀虫剂抗性的贡献则受到较少关注（Qiao et al., 2026）。这一知识空白构成了我们对昆虫多相代谢抗性网络进行全面理解的重要局限。褐飞虱因其Ⅰ相和Ⅱ相解毒机制的充分表征以及在杀虫剂抗性研究中的经典模式生物地位，为研究Ⅲ相转运蛋白在抗性中的作用提供了理想的实验系统（Li et al., 2020; Zimmer et al., 2018）。

ABC转运蛋白根据核苷酸结合结构域（NBD）和跨膜结构域（TMD）的结构特征被分为八个亚家族（ABCA–ABCH）（Hollenstein et al., 2007）。半转运蛋白含一个NBD和一个TMD，全转运蛋白则各含两个。这些膜蛋白利用ATP水解将多种底物（包括外源化合物及其共轭衍生物）进行跨膜转运（Locher, 2016; Thomas and Tampé, 2020）。在昆虫中，ABC转运蛋白已被证实通过直接外排杀虫剂或其代谢产物参与杀虫剂抗性（Dermauw and Van Leeuwen, 2014; Yang et al., 2022）。值得注意的是，ABCG亚家族是许多昆虫物种中最大的亚家族，已被反复报道与新烟碱类、拟除虫菊酯类、有机磷类杀虫剂及抗生素的解毒相关。例如，甜菜夜蛾（Spodoptera litura）体壁特异性ABCG3介导对四氯虫酰胺和氯虫苯甲酰胺的防御（Liang et al., 2025）。在烟粉虱（Bemisia tabaci）中，RNAi沉默ABCG3显著增加了吡虫啉处理后成虫的死亡率（He et al., 2018）。在褐飞虱中，已鉴定出32个ABC转运蛋白基因，其中多个成员对杀虫剂暴露具有转录应答（Li et al., 2020; Xiao et al., 2026）。其中，ABCG3已被报道与噻虫胺、啶虫脒和烯啶虫胺的抗性相关，基于RNA干扰和分子对接分析（He et al., 2026; Li et al., 2022）。尽管已有这些发现，各个ABC转运蛋白的具体功能尚未被系统表征，这构成了我们对褐飞虱代谢抗性网络理解的重要空白。

除功能表征外，近期研究也开始探索杀虫剂抗性中ABC转运蛋白表达的调控机制。microRNA（miRNA）已知参与多种昆虫中ABC转运蛋白基因的后转录调控。例如，miR-998-3p靶向ABCC2并参与鳞翅目昆虫对Cry1Ac的抗性，而miR-275调节麦长管蚜（Rhopalosiphum padi）中ABCG23L的表达，从而影响其对拟除虫菊酯类的敏感性（Tang et al., 2025; Zhu et al., 2019）。在灰飞虱中，miRNA PC-5p-3991_515对ABCG11的后转录调控与氟啶虫胺腈敏感性有关（Yang et al., 2026）。在橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）中，miR-980靶向ABCC1驱动阿维菌素抗性（Song et al., 2026）。在褐飞虱中，miRNA novel_268靶向ABCG3并与对烯啶虫胺和噻虫胺的抗性相关（Li et al., 2022）。除miRNA介导的调控外，多种转录因子已被证明控制昆虫中ABC转运蛋白基因的表达。例如，Hsf调控褐飞虱蓟替虫酰胺抗性中的ABCG7（Li et al., 2025），同源框转录因子Bcd调控甜菜夜蛾体壁特异性ABCG3（Liang et al., 2025），而小菜蛾（Plutella xylostella）ABCG1启动子的顺式作用突变消除了Hox转录因子Antp的结合，从而增强了Cry1Ac抗性（Qin et al., 2021）。然而，关于外源物质感知型转录因子对ABC转运蛋白转录调控的系统性知识仍然有限。转录因子CncC（cap'n'collar C型）通常与其小肌肉腱膜纤维肉瘤（Maf）结合伴侣共同作用，是解毒基因（包括P450s和GSTs）的主调控因子（Amezian and Leeuwen, 2025; Lu et al., 2020, Lu et al., 2021）。例如，我们此前已证明CncC/MafK通路直接调控CYP6ER1表达，对褐飞虱吡虫啉抗性有贡献（Tang et al., 2020）。类似地，芳烃受体（AhR）及其伴侣芳烃受体核转位蛋白（ARNT）在多种昆虫中调控代谢抗性基因（Hu et al., 2023; Wang et al., 2021）。我们进一步证明AhR/ARNT通路调控与吡虫啉螯合型抗性相关的化学感受蛋白（CSP）基因，且生物素水平降低触发ROS爆发，激活CncC/MafK，进而激活AhR/ARNT（Deng et al., 2026b）。然而，这些转录因子是否直接调控ABC转运蛋白基因参与杀虫剂抗性仍未知，这构成了我们对控制Ⅲ相解毒的层级调控网络理解的关键空白。

本研究利用抗性品系及其敏感对照品系，调查了ABC转运蛋白在褐飞虱吡虫啉抗性中的作用。药理学抑制、表达谱分析和RNA干扰提供了ABCG3和ABCG4对吡虫啉抗性有贡献的证据。分子对接和动力学模拟预测吡虫啉结合于ABCG3同源二聚体中心腔道附近，转录调控分析提示AhR/ARNT和CncC/MafK通路参与了抗性品系中ABCG3的过表达。这些发现支持了ABCG转运蛋白在吡虫啉抗性中的作用，并为理解褐飞虱多相代谢抗性网络中Ⅲ相解毒系统提供了更全面的认识。

## 材料与方法

### 褐飞虱品系和化学试剂

褐飞虱敏感品系（Sus）最初源于2008年在中国广州华南农业大学水稻田采集的田间种群（Lu et al., 2015）。该品系在实验室中连续饲养，未接触任何杀虫剂。吡虫啉抗性品系（Res）通过对Sus品系用吡虫啉反复选择多代获得，该品系表现出对吡虫啉的抗性，抗性倍数达402.61倍。

### 维拉帕米抑制降低Res品系的吡虫啉抗性

为评估ABC转运蛋白是否对褐飞虱的吡虫啉抗性有贡献，两种品系在施用杀虫剂前均用维拉帕米（一种公认的ABC转运蛋白抑制剂）进行预处理。在Sus品系中，维拉帕米预处理对吡虫啉毒性影响很小，仅吡虫啉组和维拉帕米预处理组的LD50分别为0.36和0.32 ng/虫，协同比为1.13。95%置信

## 讨论

本研究系统调查了ABC转运蛋白在褐飞虱吡虫啉抗性中的参与及其调控机制。我们的结果为ABCG3和ABCG4对抗性的贡献提供了证据，并预测了吡虫啉在ABCG3同源二聚体中结合的结构性见解。此外，我们将AhR/ARNT和CncC/MafK通路纳入ABCG3过表达调控的范畴。这些发现共同推进了对Ⅲ相解毒的理解

## 结论

总之，本研究提供了ABCG3和ABCG4对褐飞虱吡虫啉抗性有贡献的证据，并呈现了吡虫啉在ABCG3同源二聚体中结合的预测结构模型。鉴定AhR/ARNT和CncC/MafK通路作为ABCG3表达的潜在调控因子，表明了一个将Ⅲ相解毒与已确立的Ⅰ相和Ⅱ相解毒系统连接起来的协调网络。这些发现推进了我们的理解

## CRediT作者贡献声明

Tianxiang Xiao：验证、资源、方法学、调查、概念构思、撰写——初稿。Mengqing Deng：资源、方法学、调查、数据整理、撰写——初稿。Wenxiu Wang：资源、方法学、调查、数据整理。Kai Lu：监督、项目管理、资金获取、概念构思、撰写——审阅与编辑。

## 利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文工作的已知竞争经济利益或个人关系。

## 致谢

本工作得到国家自然科学基金（32172411）和安徽农业大学人才计划（rc342112）的资金支持。

Tianxiang Xiao | Mengqing Deng | Wenxiu Wang | Kai Lu

皖南医学院 产业-大学-研究与创新中心，中国 芜湖 241002