跨七种人细胞模型的微/纳米塑料尺寸依赖性细胞结合与内吞途径比较研究

《BioMed Research International》：Uptake of Micro- and Nano-Sized Plastic Particles in Human Cells: Size-Dependent Endocytosis and Cellular Responses

　　

微/纳米塑料（MNPs）在人体组织中越来越多被检出，但调控其细胞摄取机制仍知之甚少。本研究评估了聚苯乙烯MNPs（0.25–1.12 μm）在代表皮肤、肠、肺、肾、肝、脑和血管内皮的七种人细胞系中的尺寸依赖性细胞结合。在浓度高达100 μg/mL时，六种细胞系在24或48 h后未观察到细胞毒性，且上皮和内皮屏障完整性未受影响。若干细胞类型在48 h后显示代谢活性增加。细胞结合MNP荧光呈细胞类型和颗粒尺寸依赖模式。HEK001角质形成细胞和HMC-3小胶质细胞的细胞结合颗粒信号快速增加，0.25 μm颗粒出现明显平台；而HEK293-hTLR2肾细胞和MRC-5肺成纤维细胞在多种颗粒尺寸下随时间显示细胞结合荧光增加。Caco-2肠细胞相互作用有限，而HepaRG肝细胞和HMEC-1内皮细胞显示尺寸依赖反应。抑制研究提示，肌动蛋白依赖途径主要促进0.54–1.12 μm颗粒与细胞结合，而网格蛋白介导的内吞（CME）以高度细胞特异和尺寸特异方式参与较小颗粒相互作用。多分散混合物（polydisperse mixtures）显示细胞结合颗粒信号降低，但未受内吞抑制剂影响，进一步突出纳米塑料内化的复杂性以及组织身份和颗粒尺寸在决定细胞相互作用中的重要性。

研究背景与问题：塑料产量在2022年约达400 Mt，其中超过200 Mt进入废物流，环境降解产生微/纳米塑料（MNPs；MPs为1 μm–1 mm，NPs为1 nm–1 μm）。MNPs已在结肠、肺、肝、肾、脑和血液等人体组织检出，暴露途径包括摄入、吸入和皮肤暴露，医学来源亦有报道。然而，MNP如何与人体细胞相互作用并进入细胞仍不清楚。既有研究多集中于≤100 nm颗粒、较短暴露时间（4–24 h）和有限细胞类型，且常评估毒性而未确认颗粒结合或摄取；皮肤基底层角质形成细胞、肺成纤维细胞、肾和肝模型、脑小胶质细胞及血管内皮等存在研究缺口。为此，研究人员以标准化实验框架比较七种人细胞模型，采用0.25–1.12 μm（细胞毒性实验含0.04 μm）聚苯乙烯MNPs，考察尺寸依赖性细胞结合、内吞途径和细胞应答。研究结论显示MNPs在测试条件下多数模型未引起可检测细胞毒性，但细胞结合荧光和抑制剂反应高度依赖细胞类型与颗粒尺寸；意义在于提供跨组织比较框架，说明将单一细胞模型的MNP摄取和应答外推到其他人组织存在局限。

关键技术方法（不超过250字）：使用七种人细胞系（HEK001、Caco-2、MRC-5、HMC-3、HMEC-1来源于美国典型培养物保藏中心（ATCC）；HEK293-hTLR2来源于InvivoGen；HepaRG来源于BioPredic International），以聚苯乙烯MNPs（0.04、0.25、0.54、0.87、1.12 μm及五尺寸等质量混合物）暴露；用PrestoBlue（代谢还原活性检测）评估细胞毒性；活细胞延时成像（30 min间隔，48 h）观察颗粒-细胞相互作用；共聚焦荧光成像定量细胞结合MNP荧光（RFU/cell）；用Cytochalasin D（CytD；肌动蛋白聚合抑制剂）和Pitstop-2（网格蛋白末端结构域抑制剂）进行内吞抑制；用台盼蓝和跨上皮/内皮电阻（TEER）评估膜与屏障完整性。

研究结果：
3.1 细胞毒性：通过PrestoBlue检测0.01–100 μg/mL、24或48 h暴露，24 h各细胞系未见细胞毒性；48 h多数细胞系活力不变或代谢还原活性增加，HMEC-1暴露1.12 μm和混合物后轻度下降，其EC₅₀为模型估计值且接近或超出100 μg/mL测试上限。
3.2 纳米塑料暴露的活细胞分析：通过48 h延时成像（100 μg/mL，排除0.04 μm）观察到细胞类型和尺寸依赖的相互作用；HEK001和HMC-3快速且广泛积累，MRC-5和HEK293-hTLR2中等持续积累，HMEC-1延迟而动态，Caco-2和HepaRG相对较低。
3.3 细胞结合纳米塑料的荧光成像：通过10 μg/mL、24和48 h共聚焦成像及RFU/cell半定量发现，HEK001在24 h各尺寸显著增加后趋稳；Caco-2无显著增加；MRC-5各尺寸24–48 h持续增加；HEK293-hTLR2多数尺寸48 h增加（0.87 μm除外）；HepaRG对0.87和1.12 μm增加、0.54 μm在48 h较低、0.25 μm无显著增加；HMC-3较大颗粒和混合物24–48 h增加；HMEC-1在24 h各尺寸显著、48 h仅1.12 μm维持。作者强调荧光未跨尺寸标准化，不能解释为绝对摄取量差异。
3.4 内吞抑制：通过CytD（1 μM；活细胞48 h、定量24 h）和Pitstop-2（30 μM预处理30 min后共暴露2 h）处理，CytD显著降低1.12 μm在HEK001、HEK293-hTLR2、HMC-3和HMEC-1中的细胞结合荧光，0.87 μm在HEK001、HEK293-hTLR2和HMC-3中降低，0.54 μm在HEK001、HMC-3、HepaRG、HEK293-hTLR2和HMEC-1中降低；0.25 μm或混合物多数无显著降低，Caco-2呈增加趋势。Pitstop-2使HEK001各尺寸降低，MRC-5的0.25和0.54 μm降低，HEK293-hTLR2的0.25 μm降低而1.12 μm增加，HMEC-1仅0.54 μm降低；Caco-2和HepaRG因信号不足未分析，HMC-3因RFU增加被排除。
3.5 屏障完整性评估：通过台盼蓝排除实验（HMEC-1用10 μg/mL、Caco-2用100 μg/mL，48 h）和TEER测定，未发现显著膜损伤，暴露前后TEER无显著差异，提示上皮和内皮屏障功能保持。

讨论部分总结：研究强调其贡献不是发现尺寸依赖性摄取这一新现象，而是在颗粒特征和暴露条件一致时比较七种细胞。无急性毒性与48 h代谢还原活性增加提示部分模型可能出现增殖或应激适应反应，而非纯惰性相互作用；HMEC-1对1.12 μm和混合物的轻度活力下降提示内皮系统可能对特定尺寸和分布更敏感。MNP相互作用强烈依赖组织来源：HEK001和HMC-3快速广泛，Caco-2和HepaRG有限；Caco-2与文献差异可能涉及方法、传代和模型差异。MRC-5和HEK293-hTLR2持续结合，HepaRG和HMEC-1呈选择性动态。抑制剂结果支持肌动蛋白依赖过程和CME参与，但CytD非选择性、Pitstop-2为单一抑制剂，需互补验证；颗粒沉降可影响有效细胞剂量；多分散混合物信号较低机制未明。局限包括永生化细胞系、传代和培养差异、RFU不能明确区分膜结合与胞内颗粒、荧光未跨尺寸标准化、暴露时间短、理化性质未独立表征及等质量浓度导致颗粒数和表面积不同。

结论翻译：总体而言，在测试条件下MNPs在多数细胞模型中未产生可检测细胞毒性，但该发现不应解释为无其他生物效应。唯一例外是HMEC-1内皮细胞，在暴露于1.12 μm和混合MNPs后活力下降，提示内皮系统可能对特定颗粒尺寸和分布更敏感。细胞结合MNP荧光在24和48 h暴露期间变化，细胞类型和颗粒尺寸间模式不同。HEK001和HMC-3细胞暴露0.25 μm颗粒出现明显荧光平台，但未直接研究饱和。同样，HMEC-1细胞细胞结合荧光降低可反映包括颗粒释放或细胞分裂稀释在内的若干过程，但这些机制未独立评估。重要的是，由于荧光强度未跨颗粒尺寸标准化，这些发现应解释为细胞结合荧光差异，而非颗粒摄取的绝对定量差异。药理学抑制实验与肌动蛋白依赖过程和CME对MNP-细胞相互作用的贡献一致，这些过程的表观贡献因细胞类型和颗粒尺寸而异。相反，与多分散MNP混合物的相互作用更复杂，可能反映颗粒行为、聚集、颗粒尺寸间竞争或多个细胞过程参与的差异。总体而言，这些发现表明MNP-细胞相互作用和细胞结合荧光模式因细胞类型和颗粒尺寸而异；但无额外验证，荧光强度差异不应解释为颗粒摄取的绝对定量差异。这些发现强调比较性多组织方法和互补分析方法对于理解MNP与人细胞相互作用及其潜在健康意义的重要性。