呼吸道合胞病毒小分子进入抑制剂验证研究：基于重合成与谱学分析的假阳性筛选命中化合物再评估

《ChemMedChem》：Validation of Small-Molecule Entry Inhibitors Targeting the Respiratory Syncytial Virus

　　

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是全球范围内严重呼吸道感染的主要病原体，尤其对婴幼儿、幼儿及老年人危害显著。尽管已有疫苗和单克隆抗体等预防手段，针对急性感染的有效抗病毒治疗仍然有限。为此，研究人员通过高通量筛选（high-throughput screening, HTS）鉴定出小分子进入抑制剂，并通过重合成及抗病毒活性测定，对最具潜力的候选化合物进行了详细评估。然而，核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance, NMR）和液相色谱-质谱联用（liquid chromatography–mass spectrometry, LC–MS）分析揭示，两个化合物类别的筛选样本与重合成化合物之间存在差异，凸显了命中化合物验证的复杂性以及杂质可能产生的影响。通过公开发表这些结果，研究人员不仅旨在强调筛选活动中严格的分析与生物学验证的重要性，也期望支持开发更可靠的RSV抑制剂鉴定策略。研究人员同时认为，发表假阳性命中化合物的结果至关重要，以避免在将这些化合物视为真实命中物的项目上耗费时间与精力。

一、研究背景与目的

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是导致全球范围内严重呼吸道感染的重要病原体，尤其对五岁以下儿童、婴幼儿及60岁以上老年人危害严重。全球每年约360万例RSV相关住院病例中，约10万例为五岁以下儿童，其中半数死亡发生在6月龄以内；在60岁以上住院成人患者中，病死率约10%。RSV属于肺炎病毒科（Pneumoviridae），为包膜病毒，其包膜上的附着蛋白（G蛋白）和融合蛋白（F蛋白）共同介导病毒进入宿主细胞的过程。尽管靶向F蛋白的单克隆抗体如帕利珠单抗（palivizumab）和尼塞韦单抗（nirsevimab）已被批准用于婴儿RSV感染的预防，但针对急性感染的有效直接抗病毒药物仍然匮乏。现有小分子抗RSV药物研发主要集中于F蛋白、L蛋白和N蛋白，仅有一个小分子抑制剂靶向G蛋白。F蛋白在RSV各分离株中高度保守，氨基酸序列一致性至少达90%，因此能够较好地覆盖RSV/A和RSV/B两种亚型。已进入临床研究的RSV进入抑制剂包括BMS-433771的优化版本利来马托韦（rilematovir）、普雷沙托韦（presatovir）、西苏那托韦（sisunatovir）和齐瑞索韦（ziresovir），这些化合物均具有纳摩尔甚至皮摩尔级的体外活性和口服生物利用度。然而，目前仍无有效的FDA批准药物用于治疗严重RSV感染。为补充现有抗病毒药物储备、推动后备抑制剂进入研发管线并为联合治疗提供可能的起点，研究人员开展了高通量筛选（high-throughput screening, HTS）研究。

二、研究内容与结论

研究人员在约42000个化合物（包括小分子、ReFrame库中的药物重定位候选物及天然产物）中，利用两步RSV报告病毒感染试验进行了高通量筛选。其中10个半抑制浓度（IC₅₀）小于10 μM的小分子命中类别具有前景。两个尚未发表的命中类别（化合物6和7）在含递增浓度化合物的条件下连续传代RSV，产生了表型耐药的病毒群体，测序显示F蛋白编码序列中积累了多个非同义突变，提示F蛋白和病毒进入为推定的分子及机制靶点。这些耐药病毒群体对彼此及已知靶向F蛋白的融合抑制剂（presatovir和BMS-433771）具有交叉耐药性，表明化合物6和7可能作用于RSV-F蛋白从而抑制病毒进入宿主细胞。然而，对化合物6进行重合成并通过液相色谱-质谱联用（LC–MS）和核磁共振波谱（NMR）分析发现，初始筛选样本纯度仅为62%，其主峰质量对应中间体10而非目标化合物6或重合成产物6–1，且保留时间与合成中间体10不符。中间体10在RSV感染试验中完全无活性。1H NMR谱叠加进一步证实筛选样本中既不含重合成化合物6–1也不含中间体10，因此未对6–1进行抗病毒测试。对化合物7类别，LC–MS分析显示无明确紫外活性，化合物出现在进样峰中，检测到预期质子化化合物7a的质荷比（m/z = 246.03）及一个无法归属的质量（m/z = 258.02）。重合成的7a–1在RSV感染试验中无活性，1H NMR和LC–MS数据比较表明7a–1仅为筛选样本中至少两种组分之一。

三、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：高通量筛选（利用hRSV B05 eGFP报告病毒和RSV-A荧光素酶报告病毒进行两步感染试验）；化合物重合成（化合物6经两步合成，化合物7a经一步还原胺化）；液相色谱-质谱联用（LC–MS）和核磁共振波谱（NMR）用于化学身份验证；病毒耐药性筛选及深度测序（利用Illumina MiSeq平台，经Trimmomatic、Bowtie2、Novoalign、Picard和V-Phaser2等工具进行序列分析）用于鉴定F蛋白耐药突变。

四、研究结果

2.1 化合物类别6：研究人员通过两步合成获得重合成化合物6–1，但LC–MS分析显示初始筛选样本纯度仅62%，主峰质量对应中间体10而非目标化合物。1H NMR谱叠加证实筛选样本中既不含6–1也不含中间体10。中间体10在RSV感染试验中完全无活性（第一轮感染104% ± 9%，第二轮67% ± 9%，细胞存活率102% ± 10%），因此未对6–1进行抗病毒测试。

2.2 化合物类别7：LC–MS分析未得到明确结果，无清晰紫外活性，化合物出现在进样峰中，检测到预期化合物7a的质子化质量（m/z = 246.03）及一个无法归属的质量（m/z = 258.02）。重合成的7a–1在RSV感染试验中无活性（IC₅₀ > 3 μM），而初始筛选命中7a和7b的IC₅₀分别为0.42 μM和0.27 μM。1H NMR和LC–MS数据比较表明7a–1仅为筛选样本中至少两种组分之一。

五、结论与讨论

研究结论表明，化合物类别6和7的分析既展示了早期RSV抑制剂发现中的机遇也揭示了挑战。对于类别6，重合成和分析研究揭示了原始筛选样本与合成候选物之间的不一致性，重合成化合物6–1不存在于筛选样本中，因此未进行抗病毒测试；反而鉴定出密切衍生物10的质量为混合物主要组分，但其保留时间不同且无活性。对于类别7，重合成未能重现初始筛选命中的抗病毒活性，且无法确认活性物种的化学身份。这些发现强调了高通量筛选活动中命中验证的复杂性，杂质或未鉴定组分可能造成表观活性。研究人员建议未来研究应通过半制备高效液相色谱对筛选样本进行分级分离，并结合各馏分的NMR分析和额外生物学测试。尽管存在上述挑战，这些研究提供了有价值的方法学见解，强调严格命中确认的必要性。研究人员同时指出，发表假阳性命中结果对于避免在将此类化合物视为真实命中的项目上耗费时间具有重要意义。该研究由VW-Stiftung（9B812）资助，作者声明无利益冲突。