LAPTM5通过NEDD4-LC3轴促进线粒体自噬以保护心肌缺血再灌注损伤

《Clinical and Translational Medicine》：Lysosomal protein transmembrane 5 protects against myocardial ischemia-reperfusion injury by promoting mitophagy via the NEDD4-LC3 axis

　　

摘要 背景：线粒体自噬（mitophagy）在心肌缺血再灌注（ischemia–reperfusion, I/R）损伤期间对线粒体质量控制至关重要。溶酶体蛋白跨膜5（Lysosomal protein transmembrane 5, LAPTM5）已被证实与心血管疾病和自噬相关，但其在心肌线粒体自噬中的作用尚不清楚。 方法：研究人员采用LAPTM5基因敲除（knockout, KO）小鼠和心肌细胞靶向AAV9-cTnT-LAPTM5以确定LAPTM5在心肌I/R损伤中的作用。利用心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）模型、mt-Keima成像、线粒体分级分离、LC3-线粒体共定位、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、分子对接、定点突变、NEDD4功能获得与缺失以及p62泛素化实验来探究其潜在机制。根据数据分布和组数，研究人员采用适当的参数或非参数统计学方法，并进行多重检验校正。 结果：LAPTM5表达在I/R或H/R应激后呈进行性下降。LAPTM5缺失加重了心肌损伤、心功能障碍以及线粒体结构和功能损伤，而LAPTM5过表达则减轻了这些异常。LAPTM5通过增强LC3向线粒体的募集来促进线粒体自噬。在机制上，LAPTM5通过其PY3基序将NEDD4招募至线粒体，并促进NEDD4-LC3复合物的形成。NEDD4缺失消除了LAPTM5介导的线粒体自噬和细胞保护作用，而重新表达NEDD4-WT（而非E3活性缺失的NEDD4-CS突变体）则可恢复这些效应。NEDD4-WT还增加了p62的泛素化。AAV9介导的LAPTM5重新表达减小了梗死面积、改善了心功能，并在LAPTM5缺陷心脏中维持了线粒体完整性。 结论：LAPTM5通过NEDD4-LC3轴促进线粒体自噬，从而保护心肌免受I/R损伤。PY3依赖的NEDD4招募及其E3泛素连接酶活性促进了LC3相关的线粒体清除，并伴随p62泛素化增强，从而在再灌注期间维持线粒体稳态。 关键要点：LAPTM5通过促进NEDD4–LC3依赖性线粒体自噬来保护心肌免受缺血/再灌注损伤，从而促进线粒体清除并维持线粒体稳态。

LAPTM5在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用：通过NEDD4-LC3轴调控线粒体自噬的机制解读

一、研究背景与科学问题

心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）仍是全球死亡的首要原因。据2023年全球疾病负担分析，2023年全球约有1920万人死于心血管疾病，其中缺血性心脏病是心血管死亡和残疾的主要贡献因素之一。在急性心肌梗死患者中，约30%–50%会经历由缺血后血流恢复所触发的心肌再灌注损伤。再灌注可导致高达50%的最终梗死面积，其机制涉及坏死、内皮功能障碍、钙稳态紊乱、代谢和氧化应激、pH失衡、炎症及线粒体功能障碍。线粒体在再灌注早期尤为脆弱，氧化和离子紊乱损害ATP生成、破坏线粒体膜电位并促进心肌细胞死亡。尽管已有大量实验研究，但有效限制心肌再灌注损伤的疗法仍然缺乏，亟需阐明再灌注期间线粒体损伤和心肌细胞存活的额外分子机制。

LAPTM5是一种优先表达于造血细胞的溶酶体相关膜蛋白，日益被认为是溶酶体稳态、自噬、炎症和细胞应激反应的调节因子。结构上，LAPTM5包含五个预测跨膜区、三个富含脯氨酸的PY基序和一个泛素相互作用基序（ubiquitin-interacting motif, UIM），这些结构特征使其能够参与细胞内蛋白质运输和溶酶体分选。机制上，LAPTM5的PY基序与E3泛素连接酶NEDD4的WW结构域相互作用，而其UIM参与泛素化GGA3的招募。该LAPTM5-NEDD4-GGA3复合物的形成促进LAPTM5从高尔基体向溶酶体的转运。值得注意的是，NEDD4作为LAPTM5的已知结合伴侣，通过其保守的LC3相互作用基序直接与LC3相互作用并调节自噬体生物发生；NEDD4缺陷还导致线粒体形态异常，提示其可能参与线粒体质量控制。

线粒体自噬选择性清除受损线粒体，日益被认为是缺血应激期间心肌细胞存活的重要决定因素。鉴于LAPTM5与NEDD4之间已确立的相互作用以及NEDD4与LC3相互作用的能力，研究人员假设LAPTM5可能通过NEDD4-LC3轴调节线粒体自噬来保护缺血心脏。为验证这一假设，研究人员采用LAPTM5敲除和心肌细胞靶向LAPTM5过表达的互补功能缺失与获得策略，结合体外缺氧/复氧实验，旨在阐明LAPTM5在心肌I/R损伤中的作用及连接溶酶体信号与线粒体质量控制的先前未识别的分子机制。

二、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：LAPTM5基因敲除小鼠模型（基于CRISPR/Cas9技术构建，sgRNA靶向外显子1序列CCAGGGCTATGGTGGCGACT）及心肌细胞靶向AAV9-cTnT-LAPTM5过表达载体（经尾静脉注射，剂量为7.5 × 10¹¹ vg/只，术前2周给予）；小鼠心肌I/R手术模型（左前降支冠状动脉结扎45分钟后再灌注）；原代新生大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs）和人心肌样AC16细胞的缺氧/复氧模型；mt-Keima比率型荧光报告基因检测线粒体自噬活性；线粒体分级分离和Western blot检测线粒体蛋白；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）验证蛋白相互作用；ZDOCK分子对接预测蛋白结合界面；定点突变构建LAPTM5-PY3mut（Y259A）和NEDD4-CS（C854S）突变体；Seahorse XFe24细胞外通量分析仪检测线粒体呼吸功能；MitoSOX和JC-1染色检测线粒体活性氧和膜电位；透射电子显微镜评估线粒体超微结构；TTC染色测定梗死面积；超声心动图评估心功能；p62泛素化实验检测NEDD4 E3连接酶活性。

三、研究结果

3.1 LAPTM5在心脏IR损伤后表达下调

在小鼠心脏中，LAPTM5表达在再灌注后逐渐下降，3小时检测到显著降低，6和12小时下降更为明显。一致地，H/R刺激诱导NRVMs中LAPTM5表达呈时间依赖性降低，在复氧期间显著减少。人AC16心肌样细胞中LAPTM5水平在H/R后也显著降低，但幅度小于NRVMs。相比之下，新生大鼠心脏成纤维细胞（neonatal rat cardiac fibroblasts, NRCFs）在H/R后LAPTM5表达变化较小。这些发现表明LAPTM5下调在心肌细胞（包括人源心脏细胞）中可重复地由缺血应激诱导，而心脏成纤维细胞中的反应相对较弱。

3.2 LAPTM5缺失加重心脏IR损伤和线粒体功能障碍

LAPTM5敲除显著加重了心脏IR损伤：梗死面积增大、血清cTnI和LDH水平升高、心功能恶化（LVIDd和LVIDs扩大，LVEF和LVFS降低）、炎症因子IL-1β、IL-6和TNFα水平进一步升高。电镜显示LAPTM5缺失导致线粒体体积密度降低和嵴结构紊乱，线粒体DNA含量下降。在NRVMs中，LAPTM5敲低导致H/R后细胞活力降低、LDH释放增加、caspase-3激活和DNA片段增加；线粒体长度缩短和碎片化增加、呼吸功能障碍（基础呼吸、ATP偶联呼吸、最大呼吸和备用呼吸能力均下降）、线粒体ROS积累增加和ΔΨm丧失。

3.3 LAPTM5过表达改善IR诱导的心脏损伤和线粒体功能障碍

AAV9-cTnT-LAPTM5介导的LAPTM5过表达减小了心肌梗死面积、降低了血清cTnI和LDH水平、改善了心功能、减轻了线粒体损伤并维持了线粒体DNA含量。在NRVMs中，Ad-LAPTM5过表达减轻了H/R诱导的细胞活力丧失、LDH释放、caspase-3激活和DNA片段形成，抑制了线粒体长度缩短和碎片化、改善了线粒体呼吸功能、减少了线粒体ROS积累并维持了ΔΨm。

3.4 LAPTM5促进LC3/p62相关线粒体自噬而不改变经典线粒体自噬调节因子的丰度

透射电镜显示IR诱导的线粒体自噬损伤在LAPTM5 KO心脏中进一步加重，而LAPTM5过表达则恢复。经典线粒体自噬途径蛋白PINK1、Parkin、FUNDC1和BNIP3的线粒体丰度不受LAPTM5调节的影响。相反，LAPTM5 KO心脏IR后线粒体LC3-II和p62水平显著降低，而LAPTM5过表达则增加。氯喹（chloroquine, CQ）抑制溶酶体降解后，WT心脏中线粒体LC3-II和p62积累，而KO心脏中此反应减弱。mt-Keima分析证实LAPTM5敲低降低、过表达增加H/R条件下的线粒体自噬指数。

3.5 LAPTM5通过PY3基序将NEDD4招募至线粒体并促进NEDD4-LC3复合物形成

Co-IP证实NRVMs中LAPTM5与NEDD4、NEDD4与LC3之间的相互作用。分子对接预测LAPTM5 C端PY3基序与NEDD4 WW结构域、NEDD4的LIR基序与LC3B相互作用。PY3基序中Tyr259突变为丙氨酸显著削弱了LAPTM5与NEDD4的结合。NEDD4蛋白水平在IR或H/R刺激下显著上调，但不受LAPTM5敲除或过表达的影响。然而，LAPTM5敲低减少、过表达增加了H/R条件下线粒体相关NEDD4。在巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1, BAF）存在下，LAPTM5过表达增强、敲低减弱了NEDD4和LC3与LAPTM5的关联；NEDD4过表达增强、敲低减弱了NEDD4和LC3与LAPTM5的关联。

3.6 抑制自噬流或NEDD4缺失消除LAPTM5对IR诱导心脏损伤的保护作用

BAF抑制自噬流加重了H/R诱导的细胞损伤、LDH释放、caspase-3活性和线粒体损伤，且LAPTM5过表达不能逆转这些效应。NEDD4敲低降低了mt-Keima线粒体自噬指数和LC3-线粒体共定位，LAPTM5过表达不能挽救；NEDD4-WT重新表达恢复了线粒体自噬和细胞保护，而E3活性缺失的NEDD4-CS突变体无效。NEDD4-WT增加p62泛素化，而NEDD4-CS效果显著减弱。敲低Parkin、MUL1或ARIH1不影响LAPTM5过表达诱导的线粒体LC3-II和p62增加，而NEDD4敲低则完全消除此效应。体内CQ处理加重了IR损伤并消除了AAV9-LAPTM5的保护作用。

3.7 外源LAPTM5促进LAPTM5 KO小鼠IR损伤期间细胞存活和心功能恢复

AAV9-LAPTM5注射恢复了LAPTM5 KO小鼠心脏中LAPTM5蛋白水平，使梗死面积减少约42%，cTnI和LDH释放减少约3倍，改善了心功能（LVIDd、LVIDs和心率降低，LVEF和LVFS增加），并减轻了线粒体损伤（体积密度增加、嵴结构改善、mtDNA含量增加）。

四、讨论总结与结论

本研究首次揭示了LAPTM5在心肌I/R损伤中的保护作用及其分子机制。LAPTM5在再灌注后呈时间依赖性降低；LAPTM5缺失加重而过表达减轻IR诱导的心脏损伤、功能障碍、炎症反应和线粒体损伤；LAPTM5通过增强LC3向线粒体的募集促进线粒体自噬；机制上，LAPTM5通过PY3基序将NEDD4招募至线粒体并促进NEDD4-LC3复合物形成，NEDD4 E3连接酶活性和p62泛素化是LAPTM5介导线粒体自噬和心脏保护所必需的。这些发现确立了LAPTM5–NEDD4–LC3轴作为心肌I/R损伤中线粒体质量控制的重要调控通路。

与先前永久性心肌梗死研究中LAPTM5抑制减少炎症并改善心功能的发现不同，本研究显示LAPTM5在急性再灌注中发挥心肌保护作用，这种差异可能反映疾病背景和细胞区室的差异：永久性闭塞以炎症浸润、纤维化和慢性重塑为主，而再灌注对存活心肌细胞施加急剧的氧化和线粒体应激。LAPTM5在心肌细胞线粒体质量控制中的作用在急性再灌注中更为重要。

局限性方面：全球LAPTM5敲除模型不能完全区分心肌细胞内在效应与免疫细胞（特别是巨噬细胞）的贡献；AC16细胞不能完全重现成人心肌细胞的代谢和线粒体特征，缺乏人缺血心肌的直接证据；NRVMs与成体心肌细胞在线粒体组织、底物利用和钙处理方面存在差异；本研究主要关注I/R损伤的急性期，LAPTM5依赖性线粒体自噬在缺血后修复和重塑后期阶段的作用有待确定。

结论：LAPTM5通过促进线粒体自噬和维持线粒体稳态来保护心肌免受I/R损伤。机制上，LAPTM5促进NEDD4向线粒体的招募和NEDD4-LC3相互作用，NEDD4 E3泛素连接酶活性是LAPTM5介导线粒体自噬所必需的，并与增强的p62泛素化相关。这些发现确定了LAPTM5-NEDD4-LC3轴是心肌I/R损伤中线粒体质量控制的重要调控途径。