人参来源外泌体通过调控Bax/Bcl-2比率与AMPK-α信号选择性诱导乳腺癌细胞凋亡的机制研究

《International Journal of Breast Cancer》：Elucidation of Selective Apoptosis of Breast Cancer Cells Induced by Panax ginseng–Derived Exosomes via Regulation of Bax/Bcl-2 Ratio and AMPK-α Signaling

本研究评估了人参（*Panax ginseng*）来源外泌体（PGEs）对MDA-MB-231乳腺癌细胞的抗癌潜力，重点关注AMP活化蛋白激酶（AMPK）介导的凋亡及肿瘤细胞选择性。研究人员采用尺寸排阻色谱法分离PGE，其平均粒径为163.4 nm，浓度为1.2 × 10¹⁰ 颗粒/mL。外泌体身份通过CD9（91.4%）、CD63（96.8%）和TET-8（127.2%）表达水平的升高得以验证。PGE处理导致MDA-MB-231细胞活力呈剂量依赖性下降（在0.38 × 10¹⁰ 颗粒/mL浓度下活力为87.2%），而正常人乳腺上皮细胞（HMECs）在3.0 × 10¹⁰ 颗粒/mL浓度下仍保持90.1%的活力，表明其具有选择性诱导凋亡的作用。在划痕实验中，PGE抑制MDA-MB-231细胞迁移达29.8%，但促进HMEC增殖和迁移达88.5%，显示出选择性抗侵袭效应。分子分析显示AMPK-α、Bax、caspase-3和caspase-9表达升高，同时Bcl-2和血管内皮生长因子表达下调，从而验证了线粒体凋亡是潜在机制。流式细胞术进一步揭示MDA-MB-231细胞早期和晚期凋亡呈剂量依赖性增加（总凋亡率：17.7%–32.9%），而HMEC仅表现出极低的凋亡反应（<7.6%）。免疫荧光分析还显示MDA-MB-231细胞出现染色质凝缩、ZO-1破坏和F-actin重组，而HMEC保持结构完整性且ZO-1和F-actin强度增强。LC-MS/MS分析鉴定出人参皂苷Rf、Rh1和Rb1是PGE的主要生物活性成分，提示其参与AMPK依赖性凋亡。综上所述，这些结果表明PGE在维持正常细胞活力的同时选择性触发乳腺癌细胞凋亡，凸显其作为一种基于天然外泌体的抗癌治疗制剂的潜力，具有良好的生物相容性和转化前景。

**研究背景与目的**

癌症以失控的细胞增殖和转移性扩散为特征，是全球发病率和死亡率的主要原因之一。根据美国癌症协会《2024全球癌症统计》，癌症在2024年导致约970万人死亡，预计到2050年这一数字将上升至3500万。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症相关死亡的第二大原因，2022年报告死亡人数达517,900例，死亡率以每年1.4%的速度持续上升。乳腺癌具有高度异质性和复杂的肿瘤微环境，导致高复发率。临床上根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达对乳腺癌进行分类，这些分子标志物对预后判断和治疗决策至关重要。

在癌细胞中，凋亡受多种细胞内信号级联调控，包括线粒体通路、AMP活化蛋白激酶（AMPK）通路和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。AMPK在细胞内ATP水平降低时被激活，作为维持能量平衡、抑制生长和促进自噬的核心代谢调节因子。激活后的AMPK增强Bax促凋亡活性，Bax转位至线粒体外膜，增加通透性并促进细胞色素c（Cyt c）释放入胞质，进而形成凋亡小体并激活caspase-9，最终激活caspase-3，导致核凝缩、DNA片段化和膜出泡等典型凋亡特征。相反，Bcl-2作为抗凋亡蛋白拮抗Bax，阻止线粒体结合并阻断Cyt c释放，促进细胞存活。

目前乳腺癌化疗药物包括多柔比星、顺铂和紫杉醇，但均伴随严重不良反应，如骨髓抑制、周围神经病变和胃肠道毒性。天然活性化合物因其能够选择性诱导凋亡并靶向肿瘤微环境而受到越来越多的关注。人参中的人参皂苷属于三萜类皂苷，具有免疫调节活性，已被证明可激活AMPK信号通路，诱导自噬依赖性凋亡并抑制肿瘤生长。然而，植物化学物在体内代谢中常面临酶促降解、生物利用度差和组织特异性递送受限等问题。外泌体是50–200 nm的纳米级细胞外囊泡，富含四旋蛋白如CD9、CD63和CD81，具有良好的生物相容性和信号转导协调能力。虽然人参来源外泌体（PGEs）已被报道具有抗氧化、促进伤口愈合和减少皮肤衰老的作用，但其在乳腺癌中的抗癌功效仍不明确，特别是PGE在调节AMPK-α信号和诱导乳腺癌细胞凋亡中的作用尚未阐明。因此，本研究探讨PGE通过AMPK-α轴调控在乳腺癌中诱导促凋亡效应的作用机制，为其开发为基于天然外泌体的抗癌治疗制剂提供机制基础。

**研究内容与结论概述**

研究人员从4年生的韩国忠北阴城人参植株中分离根部，通过愈伤组织培养获得条件培养基，采用尺寸排阻色谱法（SEC）分离PGE。经纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质印迹验证外泌体特征后，研究人员以MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞和人正常乳腺上皮细胞（HMECs）为模型，系统评估了PGE对细胞活力、迁移、凋亡相关基因和蛋白表达、凋亡率、细胞结构以及人参皂苷组成的影响。结果表明，PGE在抑制乳腺癌细胞活力和迁移的同时，对正常细胞具有良好的生物相容性；其机制涉及AMPK-α介导的代谢应激、Bax/Bcl-2比率升高、caspase级联激活以及VEGF表达下调，最终通过线粒体内在凋亡通路选择性诱导癌细胞凋亡。LC-MS/MS鉴定出人参皂苷Rf、Rh1和Rb1为PGE的主要活性成分。该研究首次阐明了PGE通过AMPK-α信号通路选择性诱导乳腺癌细胞凋亡的机制，为其作为天然外泌体抗癌治疗制剂提供了坚实的实验依据。

**关键技术与方法**

本研究中，研究人员使用的主要技术方法包括：（1）利用?KTA快速蛋白液相色谱系统配合HiPrep 26/10脱盐柱进行尺寸排阻色谱分离外泌体；（2）采用ZetaView平台进行纳米颗粒跟踪分析，测定外泌体粒径分布和浓度；（3）通过蛋白质印迹检测外泌体标志物CD9、CD63和TET-8表达；（4）采用MTT法评估细胞活力；（5）使用划痕愈合实验评价细胞迁移能力；（6）通过半定量逆转录-聚合酶链反应检测凋亡相关基因表达；（7）利用蛋白质印迹分析凋亡相关蛋白表达；（8）采用Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术定量凋亡细胞比例；（9）通过免疫荧光染色观察细胞核形态、紧密连接蛋白ZO-1和F-actin细胞骨架变化；（10）采用液相色谱-串联质谱法进行人参皂苷定性和定量分析。细胞系来源：MDA-MB-231人乳腺癌细胞系购自韩国细胞系库，HMECs正常人乳腺上皮细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

**研究结果**

***3.1 外泌体表征***

通过SEC分离获得的外泌体平均直径为163.4 nm，处于外泌体50–200 nm的典型范围内。Western blot分析显示，外泌体标志物CD9和CD63表达较培养基分别升高91.4%和96.8%，植物特异性外泌体标志物TET-8表达升高127.2%，确认了外泌体身份及其植物来源。外泌体浓度为1.2 × 10¹² 颗粒/mL，远高于超滤法、PEG沉淀法和超速离心法从其他植物来源获得的外泌体产量，表明SEC是一种高产率、高纯度的外泌体分离方法，能够有效去除凋亡碎片、氨基酸聚集体和脂质颗粒等非外泌体污染物，同时保持囊泡结构的完整性。

***3.2 细胞活力分析***

MTT实验结果显示，PGE处理以剂量依赖性方式降低MDA-MB-231细胞活力：在0.38 × 10¹⁰ 颗粒/mL浓度下，活力降至86.6%，而在0.75 × 10¹⁰ 和1.5 × 10¹⁰ 颗粒/mL浓度下分别降至84.0%和83.1%。相比之下，HMEC在3.0 × 10¹⁰ 颗粒/mL浓度下仍保持90.1%的活力，差异无统计学意义（p > 0.05），表明PGE不损伤正常细胞。通过非线性回归分析估算，MDA-MB-231细胞的IC20和IC50约为7.6 × 10⁹ 和49.9 × 10⁹ 颗粒/mL，而HMEC的IC20和IC50约为26.8 × 10⁹ 和611.0 × 10⁹ 颗粒/mL，进一步证实PGE对癌细胞的选择性毒性。后续机制实验均在IC20阈值以下进行，以避免非特异性细胞毒性。

***3.3 细胞迁移***

划痕愈合实验结果显示，PGE以浓度依赖性方式抑制MDA-MB-231细胞迁移：在0.9 × 10⁹ 颗粒/mL浓度下，12 h和24 h伤口闭合率分别降低21.1%和29.8%；在3.8 × 10⁹ 颗粒/mL浓度下，24 h伤口闭合率降至55.4%。相反，HMEC在PGE处理后迁移能力增强，0.9 × 10⁹ 颗粒/mL浓度下24 h伤口闭合率提高至88.5%，表明PGE在抑制癌细胞迁移的同时促进正常细胞增殖和迁移，展现出选择性抗侵袭效应。

***3.4 基因表达分析***

半定量RT-PCR结果显示，在MDA-MB-231细胞中，PGE处理使Bax表达升高6.6%–28.9%，Bcl-2表达降低12.1%–26.3%，Bax/Bcl-2比率升高1.2–1.8倍；caspase-3和caspase-9表达分别升高1.7%–25.3%和1.0%–11.8%；AMPK-α表达升高3.3%–16.1%；VEGF表达降低6.9%–30.1%。这些结果表明PGE通过提高Bax/Bcl-2比率、激活caspase级联和AMPK-α信号、抑制VEGF介导的血管生成来诱导线粒体内在凋亡。相比之下，HMEC中Bax表达降低4.0%，Bcl-2变化微弱（–0.4%至+3.3%），caspase-3下降1.1%–1.7%，caspase-9下降7.3%–25.5%，VEGF表达升高8.5%–33.5%，表明PGE在正常细胞中不激活凋亡信号，反而促进血管生成和功能维持。

***3.5 蛋白表达分析***

蛋白质印迹结果与基因表达趋势一致。在MDA-MB-231细胞中，PGE处理使Bax蛋白表达升高30.3%–64.1%，Bcl-2降低6.6%–55.3%，Bax/Bcl-2比率升高1.4–3.7倍；caspase-3和caspase-9分别升高36.3%和34.6%；AMPK-α升高24.0%–93.2%；VEGF降低8.2%–17.4%。在HMEC中，Bax仅变化12.1%，Bcl-2升高20.9%，导致Bax/Bcl-2比率降低45.1%；caspase-3和caspase-9分别降低15.9%和28.1%；AMPK-α升高92.8%可能反映生理性代谢适应而非促凋亡信号；VEGF升高49.9%。以上结果表明PGE在蛋白水平上选择性激活乳腺癌细胞的凋亡通路，同时维持正常细胞的存活信号。

***3.6 凋亡评估***

Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术结果显示，PGE处理MDA-MB-231细胞后，活细胞比例从94.08%降至77.31%、67.96%和63.17%；早期凋亡细胞比例从0.74%升至13.87%、19.68%和23.61%；晚期凋亡细胞比例从0.07%升至3.85%、8.60%和9.27%；总凋亡比例从0.81%升至17.72%、28.28%和32.88%，均呈剂量依赖性（p < 0.001）。相比之下，HMEC在相同浓度处理后，活细胞比例维持在92.19%–93.10%，总凋亡比例仅为6.53%–7.58%，与未处理组（5.86%）相比无统计学显著差异（p > 0.05）。这些结果确证了PGE选择性诱导乳腺癌细胞凋亡而对正常细胞几乎无毒性。

***3.7 免疫荧光分析***

免疫荧光染色结果显示，在MDA-MB-231细胞中，PGE处理导致DAPI荧光强度降低7.3%–48.4%，表明染色质凝缩这一早期凋亡特征；紧密连接蛋白ZO-1荧光强度降低4.1%–27.1%，表明紧密连接破坏；F-actin荧光强度降低5.1%–37.4%且肌动蛋白丝向细胞外周重新分布，表明细胞骨架重组。相反，HMEC经PGE处理后DAPI荧光强度升高4.1%–37.2%，ZO-1升高37.1%–87.6%，F-actin升高4.2%–61.0%，证实PGE增强了正常细胞的结构完整性。这些结构与分子层面的变化共同印证了PGE通过Bax/Bcl-2调控和AMPK-α激活诱导癌细胞凋亡的特异性。

***3.8 人参皂苷定性与定量分析***

LC-MS/MS分析检测出PGE中含有三种主要人参皂苷：Rf（保留时间7.77 min，浓度2.57 mg/kg）、Rh1（保留时间9.92 min，浓度6.39 mg/kg）和Rb1（保留时间10.00 min，浓度4.03 mg/kg）。人参皂苷Rb1已被报道可通过抑制ERK和JNK磷酸化调节MAPK信号通路，并调控Bax/Bcl-2比率促进凋亡；Rh1可通过提高Bax/Bcl-2比率、激活caspase和调节AMPK-α诱导内在凋亡。这些活性成分的存在与PGE处理后MDA-MB-231细胞中观察到的基因和蛋白表达变化高度一致，表明人参皂苷是PGE抗癌活性的关键介质。PGE作为复合生物活性囊泡，其多种人参皂苷的协同作用可能共同促进AMPK-α激活、Bax介导的线粒体通透性和Cyt c释放，最终通过凋亡小体形成和caspase激活选择性诱导癌细胞凋亡。

**讨论与结论**

讨论部分指出，PGE通过多机制协同发挥抗癌作用：一方面通过AMPK-α介导的代谢应激打破癌细胞能量稳态；另一方面通过上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2、激活caspase-3和caspase-9级联反应启动线粒体内在凋亡通路；同时通过抑制VEGF表达阻断肿瘤血管生成。这种多靶点作用模式与单一化合物药物不同，降低了耐药风险。PGE对正常乳腺上皮细胞的结构稳定、迁移促进和凋亡抑制效应则体现了其良好的生物相容性和肿瘤选择性。研究存在一定局限性：仅使用MDA-MB-231一种三阴性乳腺癌模型，未与纯化人参皂苷进行直接比较，未来需要在更多乳腺癌亚型和体内模型中验证其普遍性和治疗潜力。

研究结论表明：PGE通过调控AMPK-α和MAPK信号通路，抑制乳腺癌细胞生长和迁移，同时促进凋亡，发挥强效抗癌活性。PGE可提高Bax/Bcl-2比率、激活caspase-3和caspase-9、增强AMPK-α表达并抑制VEGF，在分子水平上激活乳腺癌细胞内在凋亡。Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术证实MDA-MB-231细胞早期和晚期凋亡显著增加，而HMEC变化可忽略不计，强化了其生物相容性。免疫荧光证实PGE诱导癌细胞染色质凝缩、ZO-1减少和F-actin重组。LC-MS/MS鉴定出人参皂苷Rf、Rh1和Rb1为PGE的主要活性成分。这些结果凸显了PGE作为一种功能性外泌体抗癌材料的转化前景，人参皂苷特别是Rb1作为关键效应介质的存在，为将PGE开发为天然抗癌治疗制剂提供了坚实的科学依据。