单细胞分析揭示脊髓损伤后中性粒细胞谱系状态的时序异质性

《Neurobiology of Disease》：Single-cell analysis reveals temporal heterogeneity of neutrophil-lineage states after spinal cord injury

单细胞分析揭示脊髓损伤后中性粒细胞谱系状态的时序异质性

• 中性粒细胞谱系细胞在脊髓损伤（SCI）急性期之后仍可被检测到。
• 在多个SCI数据集中，中性粒细胞状态表现出成熟相关的异质性。
• G₃–G₅主要表现为有丝分裂后（post-mitotic）转录特征。
• 合并的G₃–G₅细胞表现出早期炎症和后期脂质相关表达。
• Ly6G共染支持IL1B和APOE表达的时序差异。

论文解读：单细胞分析揭示脊髓损伤后中性粒细胞谱系状态的时序异质性

脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种严重的神经系统疾病，常导致长期的运动、感觉和自主神经功能障碍。损伤后的继发性损伤级联包括缺血、兴奋性毒性、氧化应激、脱髓鞘和炎症等，这些过程持续数天至数周，并继续影响病变演变。炎症是继发性损伤中最突出和复杂的成分之一，中性粒细胞是最早被募集到损伤脊髓的白细胞，传统上被视为短寿命的急性炎症效应细胞。然而，中性粒细胞耗竭实验的结果存在矛盾，且近年来的单细胞研究提示中性粒细胞存在成熟和激活状态相关的异质性。尽管已有多个单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究描绘了SCI后的细胞异质性和病变结构，但中性粒细胞谱系细胞在急性期后的持续存在、成熟相关状态以及晚期功能程序仍未得到充分表征。因此，研究人员重新分析了公开的时间分辨scRNA-seq数据集，以定义SCI后中性粒细胞谱系反应的时间组织。

研究人员整合了免疫细胞富集数据集（GSE240727）和两个独立的全病变数据集（GSE189070、GSE222082），通过中性粒细胞状态注释、成熟度评估、差异表达、功能模块评分和配体-受体推断，分析了中性粒细胞谱系状态组成和表达程序的时间变化，并利用免疫荧光验证了病变核心中Ly6G⁺（中性粒细胞标记物）细胞的IL1B（白细胞介素-1β）和APOE（载脂蛋白E）相关表型。研究发现，中性粒细胞谱系细胞在SCI急性期后仍可检测到，且在多个数据集中表现出成熟相关的异质性；G₃–G₅主要表现为有丝分裂后（post-mitotic）转录特征；合并的G₃–G₅细胞显示早期炎症和后期脂质相关表达；免疫荧光共染支持IL1B和APOE表达的时序差异。这些结果重新构建了中性粒细胞在SCI中的作用框架，提示中性粒细胞谱系细胞可能同时参与早期损伤放大和后期病变重塑。

在技术方法上，研究人员使用了三个公开的啮齿动物SCI scRNA-seq数据集：GSE240727来自小鼠T10挫伤模型，样本包括未损伤及伤后1、3、7、14、28天，经CD45⁺CD11b⁺免疫细胞富集；GSE189070来自小鼠半切模型，包括未损伤及0.5、1、3、7、14、60、90天；GSE222082来自大鼠挤压伤模型，包括未损伤及1、3、7天。数据处理采用Seurat v5进行质量控制、标准化、降维、聚类和注释；根据已发表的G-state框架将中性粒细胞谱系划分为G₀–G₅状态；使用Slingshot推断拟时间轨迹；采用参考基因签名计算成熟度评分；用Wilcoxon秩和检验进行差异表达，clusterProfiler进行基因本体（GO）富集；以UCell或AddModuleScore评估功能模块；CellChat推断细胞间通讯；最后用免疫荧光验证Ly6G⁺细胞的IL1B和APOE表达。

研究结果部分如下。

3.1 时间分辨scRNA-seq揭示SCI后动态免疫重塑和持续的中性粒细胞谱系参与。通过对GSE240727数据集的重新分析，研究人员在损伤后1、3、7、14、28天均检测到中性粒细胞谱系细胞，而不仅限于急性期。UMAP聚类和标记基因表达支持这些细胞的谱系身份，表明中性粒细胞反应并非局限于短暂浸润，而是持续存在且异质性较强。

3.2 中性粒细胞谱系细胞表现出成熟相关异质性和状态组成的时间变化。研究人员提取了粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）、早幼中性粒细胞、前中性粒细胞和中性粒细胞亚群，重新聚类得到G₀–G₅六个转录状态。G₃–G₅的成熟度评分较高，细胞周期基因表达较低，主要表现为有丝分裂后特征；早期状态富集核糖体生物发生和细胞周期调控，后期状态富集白细胞迁移、趋化和先天免疫应答。时间分布上，G₅在损伤后1天占优势，而G₃和G₄在未损伤和后期更突出，说明状态组成随损伤时间发生改变。

3.3 中性粒细胞表现出功能基因程序和预测免疫信号的时间变化。在合并的G₃–G₅细胞中，损伤后1天富集炎症和趋化相关基因（如Ccl2、Ccl7、Cxcl3），而Apoe在后期升高，Gpnmb在7天最明显。GO富集显示1天富集炎症反应、细胞因子产生调节和细胞-细胞粘附，14天富集脂质定位和脂质转运，28天仍富集炎症反应。急性炎症/趋化模块评分在1天最高，脂质处理/清除模块评分在7–28天高于1天。在不同成熟度区间内，这两个模块的时间差异仍然存在。CellChat推断显示中性粒细胞与单核细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、T/NK细胞、B细胞和树突状细胞存在潜在通讯，尤其1天时与单核细胞的通讯最强，涉及Ccl6–Ccr2、Ccl12–Ccr2、Thbs1–Cd47、Spp1–Cd44等配体-受体对。

3.4 全病变scRNA-seq支持成熟相关中性粒细胞谱系状态和中性粒细胞的时间表达模式。在GSE189070全病变数据集中，中性粒细胞谱系细胞同样可被分为G₂–G₅状态，G₃–G₅成熟度评分较高，G₅在急性期（0.5、1、3天）占优势，G₃和G₄在7、14、60、90天更突出。功能模块分析显示，急性炎症/趋化模块在0.5天最高，脂质处理/清除模块在7和14天高于急性期，但在60和90天回落。在GSE222082大鼠数据集中，G₁–G₅状态也被识别，G₅在3天最突出，G₃在7天占优势，炎症模块在1天最高，脂质模块在3和7天升高。这些外部数据集验证了SCI后中性粒细胞谱系的持续存在、成熟相关异质性和时间依赖的炎症-脂质表达程序，但不同数据集在时间动力学和状态组成上存在差异。

3.5 免疫荧光验证支持损伤后时间上不同的炎症和脂质处理Ly6G⁺中性粒细胞谱系表型。研究人员在小鼠T10挫伤模型1和28天进行了Ly6G与IL1B或APOE的共染色。定量分析显示，1天时Ly6G⁺细胞中IL1B⁺细胞比例显著高于28天，而28天时APOE⁺细胞比例显著高于1天。这为scRNA-seq推测的早期炎症表型和晚期脂质处理表型提供了组织水平的验证。

研究人员在讨论中指出，中性粒细胞谱系细胞不应被视为单一群体。G₃–G₅状态虽然都具有较高的成熟度评分和较低的细胞周期评分，但它们的炎症和脂质相关特征随损伤阶段而变化。G₅在早期高度富集，符合快速急性炎症反应；后期G₃和G₄更突出，可能反映募集和局部存活条件的改变。早期炎症/趋化程序和后期脂质相关表达的共存提示中性粒细胞可能参与对富含髓鞘碎片和脂质碎片的病变环境的反应。配体-受体推断提示中性粒细胞与多种免疫细胞存在潜在通讯，但这些推断需要实验验证。独立的全病变数据集支持主要发现的稳健性，但不同损伤模型和取样时间点可能导致状态组成和反应动力学的差异。免疫荧光验证进一步支持Ly6G⁺细胞在损伤后不同时间的表型变化。局限性包括基于公开数据集的重新分析、缺乏动物水平重复、细胞比例描述性、G状态与蛋白表型的对应关系需进一步验证，以及无法区分晚期中性粒细胞来源于长期存活、外周再募集还是局部分化。

研究结论：总之，中性粒细胞谱系群体在SCI急性期后仍可检测到，状态组成随时间变化。对主要处于有丝分裂后的中性粒细胞的分析揭示了时间依赖的炎症/趋化性和脂质相关表达模式。这些发现提示中性粒细胞谱系细胞可能同时参与SCI后的早期炎症放大和后期病变重塑。