基于HR LCMS与反应性研究的DSF/Cu反应机制：以Cu(I)二乙基二硫代氨基甲酸酯为关键中间体的Cu(DTC)2生成路径探讨

《ChemBioChem》：Investigation of the DSF/Cu Reaction Using HR LCMS and Reactivity Studies

　　

铜死亡（Cuprotosis）是一种独特的细胞死亡方式，正在许多新的治疗性抗癌研究中被探索。一种广泛使用的方法是将Cu(II)盐与二乙基二硫代氨基甲酸酯二硫化物即双硫仑（disulfiram，DSF；又称酒精增敏药Antabuse）联合使用，该组合在复杂的氧化还原反应中生成毒性Cu(II)双(二乙基二硫代氨基甲酸酯)（Cu(II)bis(diethyldithiocarbamate)，Cu(DTC)₂）。研究人员将这一反应称为DSF/Cu反应；该反应中Cu(DTC)₂的生成机制已通过高分辨液相色谱-质谱（high-resolution liquid chromatography-mass spectroscopy，HR LCMS）在不同采样时间监测反应，以确定反应中间体的顺序物种形成而受到考察。该反应的其他中间体通过加入形成加合物的“捕获剂”（traps）进行表征，这些捕获剂用于表征整个反应过程中生成的硫醇（thiol）和次磺酸（sulfenic acid）物种。时间分辨谱显示，一个初始反应是DSF中硫酮（thione）部分发生2电子氧化生成sulfine（DSF-O），这意味着Cu(II)同时还原为Cu(0)。其他结果提示Cu(I)参与该反应，最可能由所用MeCN/H₂O溶液中Cu(0)与Cu(II)的归中反应（comproportionation）形成。其他中间产物表明多种硫氧化、水解以及插入/挤出（insertion/extrusion）反应形成物种，这些物种也进入生成Cu(DTC)₂的通路。

研究背景与问题：金属基抗癌治疗及铜离子载体受到关注；DSF/Cu联合可生成毒性Cu(DTC)₂，而铜死亡（Cuprotosis）依赖铜积累并影响线粒体呼吸链中脂酰化蛋白及FDX1。DSF/Cu反应中Cu(DTC)₂的生成机制仍不清楚。既往提出DSF被Cu(II)自分解并产生还原当量，或Bitt-4²⁺（DSF无水氧化生成的二价阳离子中间体）作为中间体，但Bitt-4²⁺水不稳且水解生成Cu(DTC)₂的产率低。因此，研究人员用HR LCMS时间分辨监测和捕获剂反应性研究，以确定顺序物种、Cu氧化态作用和Cu(DTC)₂生成路径。研究结论提出以Cu(I)DTC为关键中间体的暂定路径，解释了Cu(I)反应更快、Cu(II)反应受sulfine形成限速以及多物种汇入Cu(DTC)₂，并为铜死亡相关研究和Cu(I)(DTC)后续研究提供依据。

关键技术方法：采用HR LCMS在标准反应溶液（SRS，90:10% H₂O:MeCN）中不同时间点监测DSF/Cu反应，以保留时间、精确质量、同位素和MS²（二级质谱）碎片验证产物；用DMD（dimedone）和HIAM（N-[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]-2-iodoacetamide）捕获次磺酸/硫醇形成加合物；用UV-Vis测Cu(DTC)₂吸光度进行初始速率和产率分析；合成[Cu(I)DTC]₄簇、Cu₃(MeDTC)₂S₄聚合物等并用单晶X射线衍射表征。所用样品为化学合成与标准反应溶液，未涉及临床样本队列。

研究结果：
2.1 DSF/Cu反应中的产物：通过24 h化学计量DSF/CuCl₂反应的HR LCMS总离子流分析，鉴定DSOX、DOX、TETM、DSF-O及Cu(III)和Cu(I)溶剂配合物；Cu(DTC)₂水溶性差沉淀使峰较小；Cu(III)可能源于ESI氧化，Cu(I)MeCN配合物可能源于ESI还原。结论是反应产物复杂，DSOX/DOX为脱硫产物，Cu(I)盐催化脱硫提示其中间性。
2.2 产物验证：通过MS²区分同m/z的3-DOX与DSOX-O，DTC-H片段为116、88、60 m/z，MTC-H片段为100、72 m/z，并结合保留时间和同位素模式验证酮/硫酮/sulfine。结论是多种产物结构得到确认。
2.3 缓冲液的影响：通过比较缓冲液，PBS降低速率和产率，HEPES等Goods缓冲液增加速率但不增加产率；MES/MOPS磺酸盐也增加速率，可能提高CuCl₂有机相溶解度。结论是文献中DSF/Cu(II)反应可能为界面反应。
2.4 DSF/Cu反应的初始产物：通过PBS淬灭联合DMD/HIAM捕获，30 s即见DSF-O、痕量DSOX-O及DMD-DTC/DMD-MTC；20 min内>85% Cu(DTC)₂形成；DSF快速下降，DSOX上升，DOX约90 min后上升，TETM先升后降、TETMO上升；DMD-DTC/DMD-MTC先升后降；无HIAM加合物且HIAM稳定，说明无自由硫醇或铜竞争；DMD-DMD出现，推测来自DTC-亚磺酸类似物，DMD加速Cu(DTC)₂形成。结论是早期次磺酸水解和脱硫竞争支持Cu(I)络合。
2.5 Cu氧化态的影响：通过相同条件下比较CuCl与CuCl₂，产物和产率差异小；CuCl₂反应对CuCl₂为零级、对DSF约1.5级，CuCl对二者均为一级；[Cu(I)DTC]₄簇经X射线表征，难ESI/NMR，SRS中水解生成34%产率Cu(DTC)₂，加入DSF升至65%。结论是Cu(I)DTC为可行中间体。
2.6 DSF氧化：通过时间监测硫酸盐，其20 min后才增加，说明自由硫氧化成硫酸盐非主要电子源；DSF-O形成2电子氧化，Cu(0)可归中为Cu(I)；Bitt-4²⁺水解主产DOX多硫化物，而DSF/Cu中较少，故Bitt-4²⁺本身不太可能，但类似路径可转向DSF-O/DSOX-O；DTC-OH是主要初始中间体，由DSF水解生成，与CuCl₂主要生成TETM和DSOX，酸性下回到DSF。结论是DTC-OH早期生成并分支。
2.7 脱硫（Dethionation）：通过DSOX加CuCl快速生成DOX而CuCl₂反应小；TETM加CuCl生成TETMO而Cu(II)较慢；MeDTC无水与CuCl₂/CuCl反应后水解，仅CuCl₂显著生成MeTC-H；两者生成MeDTC-O和MeDTC-Ox异构体；X射线显示Cu₃(MeDTC)₂S₄聚合物。结论是Cu(I)和Cu(II)均可2电子氧化硫酮/硫醚，但该MeDTC体系中仅Cu(II)显著脱硫；HIAM未捕获H₂S与铜结合及DTC-OH反应有关。

讨论与结论：研究人员基于Cu(I)DTC提出暂定路径，强调Cu(II)氧化DSF生成DSF-O，Cu(I)与DSF按化学计量且更快生成Cu(II)DTC₂，Cu(II)速率受sulfine形成限制；Cu(DTC)₂为热力学汇，多物种可汇入。研究将Cu(I)(DTC)与Banci和Bertini提出的铜运输“亲和梯度”联系，建议用于细胞内铜死亡研究。

研究结论部分翻译：Cu(II)盐在无水有机溶剂中使DSF发生2电子氧化生成Bitt²⁺盐已众所周知。Lewis曾提出Bitt²⁺在Cu/DSF反应中的中间性及其水解的还原能力作为起始步骤。然而，在研究人员所用SRS中，Bitt²⁺盐水解生成长链多硫化物，而这些在Cu/DSF反应中未观察到。相反，Cu(II)与DSF反应生成sulfine DSF-O，即DSF的2电子氧化，这应导致Cu(II)相应还原为一个Cu(0)或两个Cu(I)离子。研究人员还发现Cu(I)与DSF按化学计量反应，最终以远快于Cu(II)的速率生成Cu(II)DTC₂。因此，Cu(II)反应速率受sulfine形成速率限制。虽然详细反应机制仍不清楚，研究人员提出溶剂化Cu(I)DTC中间体由二硫键水解生成，其随后可与DSF反应生成Cu(II)DTC₂。铜离子氧化硫物种有许多先例，通常需要O₂、NO₂或H₂O₂等外部氧化剂；同样，通过氧化硫醇还原Cu(II)生成两个Cu(I)离子也有许多先例，例如在谷胱甘肽二硫化物形成中。因此，除启动反应的生成sulfine（和亚砜）的2电子氧化外，该所提路径的大部分均有先例。该提议解释了Cu(II)相较Cu(I)盐反应较慢以及DSF过量时Cu(DTC)₂产率较高。但该研究也证明Cu(DTC)₂可由整体DSF/Cu反应中多种物种形成。毒性Cu(DTC)₂是热力学汇，总体稳定性高（logb2为15.85），解离常数（K_d）很小，为8.53×10^?19。在一篇开创性报告中，Banci和Bertini表明，蛋白质伙伴间的Cu(I)结合亲和力驱动真核生物中铜向特定细胞目的地运输，这种热力学“亲和梯度”基础是相关动力学过程的基础。该工作使用ESI-MS测量在类似细胞内条件的还原条件下以及存在竞争性螯合剂（包括DTC-H）时金属化与未金属化蛋白的浓度比。据报道，Cu(I)(DTC)的解离常数K_d为1.38×10^?8 M。相比之下，阴离子Cu(I)(DTC)₂^?仅瞬时稳定，因为会快速失去一个配体。鉴于该工作，研究人员建议可将Cu(I)(DTC)用于进一步研究细胞内铜死亡（cuproptosis）的所提效应和通路。