Cupriavidus necator H16来源的L-高丝氨酸O-琥珀酰转移酶MetXS的生化表征与晶体结构解析

《ChemBioChem》：Characterization and Crystal Structure Elucidation of the l-Homoserine O-Succinyltransferase MetXS From Cupriavidus necator H16

　　

在利用CO2生产高附加值产品的有前景微生物平台中，化学自养细菌如Cupriavidus necator H16（C. necator）因其通过卡尔文-本森-巴沙姆（CBB）循环固定CO2的能力而脱颖而出。尽管C. necator作为生物技术生产宿主已被广泛研究，但其若干生物合成途径在生化水平上仍未完全表征，这包括L-甲硫氨酸生物合成途径，其中关键酶的基于基因组的功能注释尚未经过实验验证。在本研究中，研究人员鉴定并表征了CnMetXS，一种参与C. necator中L-甲硫氨酸生物合成的L-高丝氨酸O-琥珀酰转移酶。生化表征证明，CnMetXS催化L-高丝氨酸的转琥珀酰化反应生成O-琥珀酰-L-高丝氨酸，但不表现出转乙酰化酶活性。此外，研究人员在1.86 ?分辨率下解析了CnMetXS的脱辅基晶体结构，揭示其为一个具有MetX-G2活性位点架构的同源二聚体，且活性位点lid区域呈现不同的构象。结构分析和分子对接表明，Arg335稳定琥珀酰化的酶中间体，并解释了所观察到的琥珀酰-CoA特异性。综上，这些结果确立了CnMetXS的功能，并为在C. necator中生产L-甲硫氨酸的代谢工程策略铺平了道路。

论文解读

一、研究背景与意义

化石资源的日益枯竭促使人们寻求以生物技术替代石油化工合成路线。在20种蛋白氨基酸中，大多数已可通过以葡萄糖为碳源的微生物发酵生产，但甲硫氨酸仍完全依赖石油化工路线合成。2024年全球甲硫氨酸产量约达110万吨，主要用作动物饲料添加剂。因此，建立可持续的基于发酵的甲硫氨酸生产具有高度重要性，尤其是考虑到当前化学工艺的环境约束。一个有前景的替代策略是开发能以CO₂作为主要碳源生产L-甲硫氨酸的微生物平台，利用工业尾气供CO₂可减少总碳排放。

化学自养细菌Cupriavidus necator H16（C. necator，旧称Ralstonia eutropha）是开发此类CO₂替代路线的有前景底盘菌株。该菌以积累聚羟基丁酸酯（PHB）和具有耐氧氢化酶活性而闻名，并已被成功工程化改造以生产多种高附加值产品。然而，尽管C. necator作为生物技术生产宿主已被广泛研究，其L-甲硫氨酸生物合成途径中的关键酶尚未在生化水平上得到功能验证。细菌中L-甲硫氨酸可通过两条途径合成：转硫途径和直接硫化途径。转硫途径中，L-高丝氨酸O-琥珀酰转移酶（HST，EC 2.3.1.46）催化L-高丝氨酸与琥珀酰-CoA生成O-琥珀酰-L-高丝氨酸；而直接硫化途径则由L-高丝氨酸O-乙酰转移酶（HAT，EC 2.3.1.31）催化生成O-乙酰-L-高丝氨酸。MetA和MetX属于系统发育上不同的酰基-L-高丝氨酸转移酶家族，两者无序列或结构相似性。虽然metX编码的酶主要催化转乙酰化反应，但β-变形菌纲中存在多个例外，其metX编码的酶催化转琥珀酰化反应。由于文献中普遍认为MetX的底物是乙酰-CoA，且经过生化表征的MetX型酶数量有限，这些酶通常被注释为HAT。因此，对C. necator中相应酶进行生化表征以绘制该化学自养菌的完整生物合成途径至关重要。

二、研究内容与主要结论

本研究报道了C. necator来源的HST（CnMetXS）的鉴定、异源表达和体外表征。研究人员确定了多项生化参数，包括pH和温度最适条件、热稳定性、底物范围以及琥珀酰-CoA和L-高丝氨酸的动力学参数。此外，研究人员在1.86 ?分辨率下解析了CnMetXS的X射线晶体结构，揭示了其在C. necator L-甲硫氨酸生物合成中作为转琥珀酰酶的角色。结合对C. necator中metXS基因的基因组背景分析，生化证据表明该自养菌是少数能够使用直接硫化途径进行L-甲硫氨酸生物合成的β-变形菌之一，即使在存在HST CnMetXS的情况下也是如此。该研究为在C. necator中生产L-甲硫氨酸的代谢工程策略铺平了道路。

三、关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过基因组同源搜索鉴定metXS候选基因并分析其基因组背景；将目的基因亚克隆至pET-28a(+)表达载体，在E. coli BL21(DE3)中异源表达重组酶并进行镍亲和纯化；采用基于Fmoc-Cl衍生化的高效液相色谱（HPLC）方法测定酶活性及动力学参数；利用差示扫描荧光法（DSF）评估蛋白热稳定性；通过尺寸排阻色谱（SEC）分析寡聚状态；采用X射线晶体学方法解析蛋白三维结构，并使用YASARA软件进行分子对接模拟。

四、研究结果

4.1 metXS在C. necator中的基因组背景

研究人员在C. necator 1号染色体上鉴定到编码推定MetXS的候选基因，全基因组同源搜索确认该基因在基因组中仅存在单拷贝。metXS基因邻近区域存在编码MetW的基因，MetW在γ-变形菌中已被表征为MetX活性所需的调控蛋白。另一个与L-甲硫氨酸代谢相关的基因metK1（编码L-甲硫氨酸腺苷转移酶）也位于metXS位点附近。C. necator中注释了两个O-琥珀酰高丝氨酸巯基解酶同源物：1号染色体上的metZ1和2号染色体上的metZ2，但未鉴定到胱硫醚γ-合酶（MetB）同源物。MetZ1和MetZ2是与MetY同源的巯基解酶，特异性以O-琥珀酰-L-高丝氨酸为底物，这表明该生物可能通过直接硫化途径合成L-甲硫氨酸，即使存在HST也是如此。这使C. necator成为已知的例外之一。

4.2 CnMetXS的生化表征

活性测定证实CnMetXS是一个功能性HST，催化琥珀酰-CoA和L-高丝氨酸转化为O-琥珀酰-L-高丝氨酸。除L-高丝氨酸外，该酶还接受L-丝氨酸作为替代酰基受体。动力学参数测定显示，琥珀酰-CoA的k_cat为6.14 ± 0.46 s^–1，K_m为0.31 ± 0.05 mM，催化效率k_cat/K_m为1.98 × 10⁴ M^–1 s^–1；L-高丝氨酸的k_cat为6.13 ± 0.46 s^–1，K_m为1.10 ± 0.17 mM，催化效率为5.57 × 10³ M^–1 s^–1。乙酰-CoA作为底物时无活性。pH活性谱显示最适pH在近中性至微碱性范围。DSF测定表明该酶在20 mM Tris缓冲液（含150 mM NaCl，pH 7.5）中熔解温度为37.5 °C，柠檬酸会降低热稳定性而NaCl浓度升高可稳定蛋白。温度依赖性分析显示酶活性在约40 °C时最高，但考虑到较低的熔解温度，高于此温度可能导致部分酶变性。SEC分析显示该酶以约86 kDa的表观分子量洗脱，与溶液中二聚体状态一致。

4.3 CnMetXS的结构解析

晶体结构在1.86 ?分辨率下解析，空间群为P2₁，不对称单元含两个CnMetXS分子形成同源二聚体。每个单体呈现MetX样高丝氨酸酰基转移酶特征的双结构域架构，包含α/β-水解酶催化核心（残基1–195和303–393）和lid结构域（残基196–302）。活性位点位于两结构域之间，含有由Ser168、Asp333和His366组成的经典α/β-水解酶催化三联体。活性位点组成支持将CnMetXS归类为MetX-G2型高丝氨酸O-琥珀酰转移酶。MetX-G2/G3型的琥珀酰-CoA特异性与关键精氨酸残基相关，在CnMetXS中对应Arg335，该残基被推测用于稳定琥珀酰化丝氨酸中间体的羧酸基团。结构比对显示CnMetXS与代表性MetX同源物的Cα RMSD为0.9–1.7 ?，保留了保守的MetX支架和活性位点组织，但在与酰基供体特异性相关的位点存在局部差异。值得注意的是，两个单体在lid区域的Thr244–Ala291区段呈现不同构象，导致不对称的活性位点架构。链A的Arg335位于催化中心附近，更适合生产性酰基供体结合；而链B中Tyr245所在环重排进入活性位点使入口变窄，Arg335偏离Ser168区域，形成不利于催化的重排状态。

4.4 分子对接研究

由于浸泡和共结晶实验均未获得底物或琥珀酰化Ser168中间体的可解释电子密度，研究人员进行了分子对接实验。将Ser168模拟为琥珀酰化状态后，L-高丝氨酸成功对接至链A活性位点，由Asn71、琥珀酰化Ser168、Tyr245、Tyr294、Arg335和His366等多个关键残基稳定。L-高丝氨酸的羟基与琥珀酰基紧密相邻，符合亲核背面进攻的几何要求。重要的是，Arg335与琥珀酰基的末端羧酸基团相互作用，支持其在稳定CnMetXS琥珀酰化中间体中的推测作用。而链B因活性位点被Tyr245收窄且Arg335移出活性位点，无法获得合理的对接位置。

五、讨论与结论

本研究表明C. necator很可能遵循直接硫化途径进行L-甲硫氨酸生物合成，即使琥珀酰转移酶的存在通常与转硫途径相关。结构分析揭示了活性位点入口的不对称构象，链A比链B更适合生产性配体容纳，但这种不对称性可能受晶体堆积影响，其在溶液中的功能意义尚待确定。序列和结构特征将CnMetXS归入MetX-G2组HST，凸显了metX编码酶催化功能的多样性。这些发现扩展了对β-变形菌中L-甲硫氨酸生物合成的理解，提供了首个来自C. necator的MetX型HST的详细表征，并确立MetXS作为未来代谢工程改造以提高C. necator中L-甲硫氨酸生物合成的靶点。