胶带剥离人角质层中游离型A型肉毒神经毒素（BoNT/A）痕量定量的适用性反相HPLC–UV工作流程建立与验证

《Microchemical Journal》：it-for-purpose reversed-phase HPLC–UV workflow for trace quantification of free-form botulinum neurotoxin type a in tape-stripped human stratum corneum

符合目的的反相高效液相色谱–紫外检测（HPLC–UV）工作流程可对胶带剥离人角质层（SC）中的A型肉毒神经毒素（BoNT/A）进行定量。在定量下限（LLOQ）为8.06 pg/mL时实现了痕量BoNT/A定量。无需纯化的简单提取可最大限度减少潜在分析物损失。针对SC的验证满足预先设定的基于ICH M10的接受标准。该工作流程为酶联免疫吸附测定（ELISA）和液相色谱–质谱（LC–MS）方法提供了一种可及的替代方案。

Sorrayut Mongkoltipparat等针对A型肉毒神经毒素（BoNT/A，botulinum neurotoxin type A）皮肤递送评价中的分析缺口开展研究。BoNT/A为强效神经毒性蛋白，第二代无神经毒素相关蛋白（NAPs）制剂因免疫原性较低、纯度较高和药理表现更可预测而适于重复或长期给药。但角质层（SC，stratum corneum）是局部和透皮递送限速屏障；BoNT/A为大分子亲水蛋白，分配和扩散差且易受蛋白酶降解，需皮内注射或微针等递送。胶带剥离可无创评估人SC摄取，但胶带黏合剂和SC成分干扰分析；治疗单位中活性毒素质量极低，提取后可回收浓度可降至pg/mL级。酶联免疫吸附测定（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay）受抗体可得性、特异性和开发周期限制，液相色谱–质谱（LC–MS，liquid chromatography–mass spectrometry）可能受离子抑制影响。反相高效液相色谱–紫外检测（HPLC–UV，high-performance liquid chromatography–ultraviolet detection）广泛可得、简单经济，BoNT/A疏水性和紫外吸收残基支持直接检测；据作者所知，尚未用于胶带剥离人SC中BoNT/A定量。因此研究旨在建立并验证符合国际人用药品注册技术协调会（ICH，International Council for Harmonisation）M10的可靠、快速生物分析方法，用于人SC中游离型BoNT/A定量。研究人员开发并验证了符合目的的反相HPLC–UV工作流程，证明可在验证范围内实现pg/mL级痕量定量，方法具有可接受选择性、特异性、准确度、精密度、低基质效应和残留可忽略及足够稳定性；其意义是为未来皮肤药代动力学（DPK，dermato-pharmacokinetics）研究和制剂评价提供可及分析工具。

关键技术方法（≤250字）：采用反相HPLC–UV（光二极管阵列PDA检测，丁基硅烷C4柱，TFA/水–乙腈梯度，220 nm）分离定量BoNT/A，20 mM Tris–HCl（pH 7.0）提取胶带剥离SC，外标法校准；按ICH M10并辅以AOAC等标准验证选择性、特异性、校准曲线与范围、准确度、精密度、定量下限（LLOQ，lower limit of quantification）、基质效应、残留和稳定性，并进行强制降解（FD，forced degradation）及峰纯度/再分析确认；用ProtParam计算BoNT/A与主要SC蛋白理化性质。样本来源为6名20–40岁健康志愿者前臂掌侧胶带剥离SC，经Siriraj Institutional Review Board批准，体外加标BoNT/A，未向受试者给药。

研究结果：3.1 生物分析方法开发与优化：选择C4反相柱、Tris–HCl pH 7.0提取和220 nm检测，优化梯度后BoNT/A峰尖锐对称，与SC蛋白和人血清白蛋白（HSA，human serum albumin）分离，分辨率6.5、理论塔板数（NTP，number of theoretical plates）31,126；理化性质差异解释选择性。3.2 生物分析方法验证：按ICH M10验证显示选择性、特异性、pg/mL级定量、LLOQ、准确度、精密度、低基质效应、残留可忽略和稳定性可接受。3.3 在皮肤成分、降解产物和制剂相关干扰存在下的方法选择性和特异性：3.3.1 选择性：6份空白基质中皮肤干扰约6.0 min，BoNT/A约5.0 min，无重叠；3.3.2 特异性：HQC、CS、安慰剂和FD样品峰纯度>0.99，HSA约7.0 min、蔗糖无UV峰，分辨率>1.5，酸/碱/热胁迫下部分降解，酸3 h峰完全消失，收集峰再分析确认。3.4 基于响应线性和定量限的方法灵敏度评价：3天校准曲线R² 0.9966–0.9993，斜率显著非零、截距不显著，残差随机；计算LLOQ 7.20 pg/mL，实际LLOQ 8.06 pg/mL；采用外标法，未评估稀释完整性。3.5 准确度、精密度、基质效应、残留和稳定性支持的方法可靠性：3.5.1 准确度和精密度：HQC/MQC/LQC准确度85–115%、LLOQ 80–120%，相对标准偏差（RSD，relative standard deviation）分别≤15%和≤20%，实际LLOQ准确度91.7–119.0%、RSD 2.1–5.0%；3.5.2 基质效应：3个独立SC来源HQC/LQC准确度±15%、RSD≤15%；3.5.3 残留：最高CS后空白无BoNT/A峰；3.5.4 稳定性：未处理样品2–8 °C 34天、处理后15 °C 64 h准确度可接受，未单独评估bench-top稳定性。3.6 常规生物分析质量控制策略和研究局限：建议系统适用性试验（SST，system suitability testing）监测保留时间RSD≤2%、峰面积RSD≤5%、拖尾因子≤2.0、分离度≥1.5，并在每批加入LQC/MQC/HQC；局限包括UV无分子级结构确认和超高灵敏度、未扩展至临床真实样品/其他血清型/复杂制剂/更深皮肤层、未独立量化绝对提取回收率、无SI溯源认证参考物质、IU-to-mass不可外推。

讨论部分总结：作者强调方法新颖性在于首个针对胶带剥离人SC中游离型BoNT/A的实用且经验证的反相HPLC–UV工作流程，而非更高灵敏度；其简单、经济、适用性验证支持痕量SC生物分析和制剂研究，但需用认证参考物质提高溯源性和不确定性评价，并建议未来用正交LC–MS/MS确认、真实给药后样品、微针等递送系统比较及其他蛋白药物适配。

研究结论翻译：研究人员成功开发并验证了一种符合目的的反相HPLC–UV方法，用于定量胶带剥离人SC中的游离型BoNT/A。验证基于ICH M10原则和接受标准，并对重复数和基质来源作了科学论证的修改。方法在复杂皮肤基质中对BoNT/A显示可接受选择性和特异性，与内源性SC成分、制剂辅料和降解产物清晰分离；在验证范围内实现pg/mL级可靠痕量定量，并获得可接受准确度、精密度、极小基质效应和残留及足够稳定性。尽管已有高灵敏BoNT/A测定用于效价测试或生物体液分析，但其在胶带剥离SC基质中的应用可能受基质复杂性、成本和工作流程要求限制。该工作的新颖性不在于更高分析灵敏度，而是建立首个针对胶带剥离人SC中游离型BoNT/A定量的实用且经验证的反相HPLC–UV工作流程。该方法为SC样品中BoNT/A定量提供可及分析平台，可支持未来以SC为重点的生物分析和制剂研究。由于报告浓度源自商业制剂的制造商定义含量，不应解释为完全计量溯源的绝对值；未来工作应包括在有认证参考物质时进行标准化，以实现可溯源定量和更严格不确定度评价。其他研究可将该方法扩展至BoNT/A给药或递送后真实样品、微针等替代递送系统比较及其他蛋白治疗药物。总体而言，该方法的简单性、成本效益和适用性验证支持其在痕量SC生物分析和制剂研究中更广泛应用。