抑制Tau微管蛋白激酶1通过改变激酶网络减轻tau磷酸化及Aβ介导的神经毒性

《Molecular & Cellular Proteomics》：Suppression of Tau-tubulin kinase 1 mitigates tau phosphorylation, and Aβ mediated neurotoxicity via altered kinase network

　　

摘要专业翻译 Tau微管蛋白激酶1（Tau-tubulin kinase-1，TTBK1）是一种神经元特异性的丝氨酸/苏氨酸tau激酶，在内嗅皮层和海马区域高表达，并在与阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）相关的位点磷酸化微管相关蛋白tau，从而促进早期tau病理。靶向TTBK1可能是一种有前景的AD治疗方法，尽管抑制TTBK1如何改变神经元功能目前尚不清楚。本研究展示了利用串联质量标签（tandem mass tag，TMT）和数据非依赖采集液相色谱/质谱（data independent acquisition liquid chromatography/mass-spectrometry，DIA-LC/MS）对转导表达靶向小鼠Ttbk1短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）的腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）的小鼠原代皮层神经元进行的蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析。通过shRNA转导抑制TTBK1表达可增加神经元中间丝蛋白和液泡H+-ATP酶（vacuolar H+-ATPase，V-ATPase）V1结构域亚基的表达，提示TTBK1对细胞骨架动力学和溶酶体活性具有调控作用。沉默Ttbk1可显著降低TTBK1和微管相关蛋白1A（microtubule-associated protein 1A，MAP1A）的磷酸化，同时增加神经元中间丝蛋白的磷酸化，表明其参与微管相关蛋白的调控和轴突稳定化。磷酸化位点特异性特征分析鉴定了受TTBK1调控的激酶，包括AD相关的细胞周期蛋白依赖性激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5）和AKT1。沉默Ttbk1可显著降低CDK5激活因子p25/p35比值及pT231磷酸化tau水平，与CDK5活性降低一致。最后，沉默Ttbk1可减轻淀粉样β（amyloid-β，Aβ）诱导的体外神经毒性。这些结果表明，TTBK1与其他激酶在维持轴突稳态（通过微管相关蛋白磷酸化）及介导Aβ毒性方面存在密切的功能关系或协调调控，从而强调TTBK1是AD的一个新兴治疗靶点。

论文解读

一、研究背景与科学问题

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）以淀粉样斑块沉积（主要由淀粉样β肽（amyloid-β，Aβ）构成）、神经原纤维缠结（由过度磷酸化和错误折叠的微管相关蛋白tau组成）以及神经元丢失为主要病理特征。tau蛋白的磷酸化由特定激酶（tau激酶）调控，包括细胞周期蛋白依赖性激酶5（cyclin-dependent kinase 5，CDK5）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）和Tau微管蛋白激酶1（Tau-tubulin kinase-1，TTBK1）。TTBK1是一种独特的神经元特异性tau激酶，已被视为tau蛋白病（包括AD）的潜在治疗靶点。已有研究证实，靶向小鼠Ttbk1的反义寡核苷酸脑室内给药可显著降低PS19 tau蛋白病小鼠脑内磷酸化tau水平；药理学抑制原代神经元中的TTBK1可减少多个疾病相关位点的tau磷酸化。此外，人类AD脑组织的大规模蛋白质组学分析将tau鉴定为AD进展中最显著失调的蛋白质，TTBK1被认为是其关键调控因子之一。TTBK1在AD早期阶段发挥关键作用，其pS483位点磷酸化与AD病理相关。TTBK1直接磷酸化tau的pS202/pT205（AT8识别位点）和pS422（前缠结标志物），并被鉴定为pT231位点的主要激酶——该位点是一种有前景的血浆AD生物标志物，与淀粉样β正电子发射断层成像显著相关。然而，抑制TTBK1如何改变神经元功能尚不完全清楚，TTBK1与CDK5及tau之间的直接或间接分子关系也尚未完全阐明。因此，本研究旨在通过质谱-based蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学全面阐明原代培养小鼠皮层神经元中Ttbk1沉默的效果，并探讨其多种底物与其他激酶之间的相互作用。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）在原代小鼠皮层神经元中实现Ttbk1的选择性敲低（敲低效率达83%，且不影响同源基因Ttbk2），结合串联质量标签（tandem mass tag，TMT）磷酸化蛋白质组学、数据非依赖采集液相色谱/质谱（data independent acquisition liquid chromatography/mass-spectrometry，DIA-LC/MS）总蛋白质组学以及活细胞成像等技术，系统分析了TTBK1抑制对神经元蛋白质组、磷酸化网络和Aβ神经毒性的影响。研究发现，TTBK1抑制不仅降低tau磷酸化，还通过调控多种激酶（尤其是CDK5）的活性网络，增强神经元中间丝蛋白和溶酶体V-ATP酶表达，从而发挥神经保护作用。该研究确立了TTBK1作为AD新兴治疗靶点的重要地位。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：基于AAV-shRNA的基因沉默技术（使用AAV PHP.eB血清型，可高效转导原代神经元）；串联质量标签（TMT）标记结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的磷酸化蛋白质组学分析（利用Fe(III)-IMAC富集磷酸肽，采用数据依赖采集模式）；数据非依赖采集（DIA）结合气相分级（GPF）的液相色谱-质谱总蛋白质组学分析；生物信息学分析工具包括MaxQuant、Perseus、Ingenuity Pathway Analysis（IPA）和PTM-SEA（基于PTMsigDB数据库的磷酸化位点特征分析）；以及IncuCyte S3活细胞成像系统用于神经毒性动态监测。样本来源于CD-1小鼠胚胎（E16.5）的原代皮层神经元，每组4个生物学重复。

四、研究结果

1. 抑制Ttbk1可阻止磷酸酶抑制诱导的tau磷酸化

通过qPCR确认shTtbk1转导在DIV14时使Ttbk1 mRNA水平较shScr对照降低83%，且不影响Ttbk2表达，证明选择性敲低成功。研究人员使用蛋白磷酸酶1（PP1）和2A（PP2A）抑制剂冈田酸（okadaic acid，OA）模拟AD样tau磷酸化（因AD中PP2A活性降低），确定60分钟为检测pS422 tau（TTBK1直接磷酸化位点）的最佳时间点。结果显示，Ttbk1敲低可显著降低OA诱导的pS422水平，而AT8、PHF-1和pT181位点磷酸化无显著变化，证实了shRNA对Ttbk1的亚型特异性沉默及对tau pS422的特异性抑制。

2. TTBK1蛋白减少增加神经元中间丝蛋白和溶酶体V-ATPase蛋白表达

总蛋白质组学分析鉴定出9,094个蛋白质，主成分分析显示OA处理是全局蛋白质组变异的主要来源（PC1占47.8%），而shTtbk1敲低效应体现在次要成分（PC2占11.5%）。与shScr相比，shTtbk1显著改变66个蛋白质（44个上调，22个下调，BH-FDR q<0.05，倍数变化±1.3）。值得注意的是，Ttbk1抑制导致神经元中间丝蛋白（包括α-内连蛋白（INA）、神经丝轻链（NEFL）和神经丝中链（NEFM））上调，这些蛋白可结合微管并促进其聚合，提示TTBK1下调可能通过稳定细胞骨架促进神经突延伸。此外，突触囊泡蛋白Synaptogyrin 3（SYNGR3）和液泡H⁺-ATP酶（V-ATPase）V1结构域相关蛋白（ATP6V1）也上调。基因本体论（Gene Ontology，GO）分析显示最显著富集的分子功能和细胞组分条目与ATPase活性相关，富集的生物学过程包括突触囊泡成熟、突触囊泡腔酸化和神经元细胞稳态。

3. TTBK1通过其密切的激酶网络影响轴突稳定性

TMT磷酸化蛋白质组学定量了4,088个蛋白质上的19,164个磷酸化位点，其中157个位点在Ttbk1敲低后显著改变（82个增加，75个减少）。火山图分析显示下调位点映射到TTBK1和MAP1A，上调位点映射到中间丝蛋白。TTBK1自身有15个磷酸化位点被定量，其中10个显著减少，包括pS484（小鼠）/pS483（人）——一个在AD脑磷酸化蛋白质组分析中报道的与AD病理网络相关的位点。此外，Ttbk1沉默还影响多种细胞骨架调控因子的磷酸化，包括微管结合蛋白（MAPT、MAP1B、MAP4和CLASP1）。探索性上游调控因子分析提示生长激素1（GH1）、神经肽Y（NPY）和CDK5可能受Ttbk1沉默影响；PTM-SEA分析显示AKT1底物显著下调。已知CDK5底物的磷酸化变化不一，但CDK5被IPA分析列为潜在上游调控因子。

4. TTBK1抑制改变CDK5相关信号并减少tau pT231磷酸化

Western blot分析显示，shTtbk1处理组中p25/p35比值显著降低，表明TTBK1通过促进p35裂解来激活CDK5。tau pT231（一个已确立的AD血浆生物标志物，也是CDK5的已知底物）水平在shTtbk1处理神经元中较shScr对照显著降低，与TTBK1抑制下CDK5活性降低一致。值得注意的是，磷酸化蛋白质组数据中该位点的磷酸肽未显示显著变化（倍数变化0.90–1.00），研究人员认为这种差异可能反映两种方法定量原理的不同：抗体检测反映全细胞裂解液中pT231信号相对总tau的水平，而TMT定量报告特定胰蛋白酶磷酸肽的丰度，受邻近修饰和所选肽段种类影响。

5. 抑制Ttbk1延缓寡聚Aβ诱导的神经毒性

在原代皮层神经元中，研究人员在DIV7转导shTtbk1或shScr，DIV14时加入10 μM寡聚Aβ42，通过IncuCyte S3活细胞成像每2小时监测神经突长度和细胞体簇面积，持续44小时。结果显示，shTtbk1转导的神经元在整个成像期间表现出保持神经突长度和细胞体簇面积的趋势，而shScr对照则表现出进行性神经突碎裂和细胞体面积丧失，表明抑制Ttbk1可延缓寡聚Aβ诱导的神经毒性。

五、结论与意义

本研究通过系统的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，揭示了TTBK1抑制的多方面效应：不仅降低tau磷酸化（尤其是pS422和pT231位点），还通过调控CDK5活性网络（降低p25/p35比值）影响下游信号通路。同时，TTBK1抑制增加了神经元中间丝蛋白和溶酶体V-ATPase的表达，提示其在维持细胞骨架稳定性和溶酶体功能中的调控作用。功能实验证实，Ttbk1沉默可减轻Aβ诱导的神经毒性，保护神经元形态完整性。这些结果共同表明，TTBK1与其他激酶（特别是CDK5）在维持轴突稳态和介导Aβ毒性方面存在密切的功能关系或协调调控。该研究确立了TTBK1作为AD新兴治疗靶点的重要地位，为开发针对TTBK1的AD治疗策略提供了全面的分子机制依据。