红罗非鱼肠道潜在益生菌的分离、表征与分子鉴定研究

《Environmental Microbiology Reports》：Isolation, Characterization and Molecular Identification of Putative Probiotic Bacteria From Red Tilapia Gut

　　

摘要专业翻译 益生菌的使用是水产养殖中增强鱼类健康和可持续性、替代抗生素的一种有前景的策略。本研究采用系统的多标准筛选方法，从健康红罗非鱼（Oreochromis sp.）的肠道菌群中鉴定本土益生菌候选菌株。研究人员共获得26株可培养细菌分离株，并评估了其针对主要鱼类病原菌（嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila、无乳链球菌 Streptococcus agalactiae 和海豚链球菌 Streptococcus iniae）的抗菌活性、安全性、模拟胃肠道条件耐受性、黏附相关特性、酶活性及环境适应性。仅一小部分分离株表现出广谱抗菌活性，并满足后续安全性和功能性标准。基于综合表现，研究人员筛选出3株分离株进行深入评估，其中2株被保留用于分子鉴定。通过16S rRNA基因测序，所选菌株被鉴定为铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa PA4（PA4）和芽孢杆菌属 Bacillus sp. BA4P（BA4P）。两株菌均表现出胃肠道应激耐受性、可测量的黏附相关疏水性、多种酶活性以及在不同温度和盐度条件下的稳定性。这些发现为筛选宿主相关益生菌提供了可靠的框架，并支持PA4和BA4P作为可持续罗非鱼养殖潜在候选菌株的进一步评估。

论文解读

一、研究背景与研究意义

水产养殖是全球增长最快的食品生产部门之一，为人类提供大量优质动物蛋白。罗非鱼养殖在满足这一需求中发挥着核心作用，其中红罗非鱼（Oreochromis sp.）因其生长迅速、环境适应性强和市场需求旺盛而备受重视。然而，集约化养殖实践常导致疾病暴发、生长性能下降，以及因过量和不恰当使用抗生素而造成的环境影响。罗非鱼消化系统相对简单，限制其分解复杂饲料成分的能力，往往导致饲料转化率（FCR）不理想。此外，集约化养殖增加了鱼类对机会性病原菌（如无乳链球菌、气单胞菌属和弧菌属）的易感性。传统上使用抗生素控制感染已导致抗菌素耐药性（AMR）的出现和生态失衡，凸显了寻找可持续替代方案的迫切性。

益生菌作为可持续干预手段受到广泛关注。FAO/WHO指南将益生菌定义为：当以足够剂量施用时，能为宿主带来健康益处的活微生物。其在水产养殖中的有益作用包括病原菌竞争性排斥、增强肠道屏障完整性、调节免疫反应以及产生消化酶。然而，益生菌性能高度依赖于宿主特异性，商业益生菌多来源于非鱼类来源，其在红罗非鱼中的功效研究尚不充分。相比之下，直接从目标物种肠道菌群中分离的宿主来源益生菌，天然适应宿主肠道环境，更有可能有效定植、与病原菌竞争并增强消化酶活性。因此，本研究旨在从健康红罗非鱼肠道菌群中分离潜在益生菌，系统表征和筛选核心益生菌特性，并利用16S rRNA基因测序进行分子鉴定。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员从印度喀拉拉邦Thrissur地区商业水产养殖场土塘中采集健康红罗非鱼，在实验室适应48小时后，随机选取6尾健康成年鱼（体重150–200 g）进行肠道取样。采用多阶段系统筛选流程：通过系列稀释和多种选择性/非选择性培养基平板培养分离肠道细菌；采用琼脂孔扩散法评估分离株对三种主要鱼类病原菌的抗菌活性；通过溶血活性检测、抗生素敏感性试验（Kirby–Bauer纸片扩散法）和红罗非鱼体内安全性评价（腹腔和肌肉注射）进行两级安全评估；通过模拟肠液（SIF）和模拟胃液条件评估胃肠道耐受性；通过二甲苯微生物黏附碳烃法测定细胞表面疏水性；通过CAS琼脂法检测铁载体产生；通过多种底物平板法评估蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、脲酶、磷酸酶等酶活性；通过温度梯度和盐度梯度评估环境适应性；最终通过16S rRNA基因扩增、Sanger双端测序和系统发育分析完成分子鉴定。

三、研究结果

分离与表型多样性： 研究人员从健康红罗非鱼肠道共获得26株可培养细菌分离株，在菌落形态（大小、色素、隆起、表面质地和边缘特征）上表现出显著表型多样性。显微镜检查显示所有分离株均为杆状，其中多株具有内生孢子形成能力。

对鱼类病原菌的抗菌活性： 大多数分离株（17/26）未表现出可检测的拮抗活性，少数菌株抑制1种（5株）或2种（1株）病原菌，仅3株（PA4、BA4P和BA4G）对全部三种病原菌均有抑制作用。定量评估显示，针对嗜水气单胞菌和海豚链球菌，PA4产生的抑菌圈最大，其次为BA4P；而针对无乳链球菌，BA4P的抑制作用最强，显著超过PA4。PA4和BA4P表现出优越且互补的抗菌潜力。

候选菌株安全性： 所有候选菌株（PA4、BA4P和BA4G）均表现为γ-溶血（无溶血活性）。体内安全性评价显示，腹腔注射候选菌株后未出现处理相关死亡，14天后各处理组存活率与对照组无显著差异（p = 0.33）。抗生素敏感性分析显示三株菌对所测试的11种临床相关抗生素均广泛敏感，无非典型耐药模式。血浆生化分析中，处理组鱼的谷草转氨酶（GOT）和谷丙转氨酶（GPT）活性与对照组相当，碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（CRE）和血尿素氮（BUN）均低于检测阈值，表明候选菌株对红罗非鱼生理安全。

细胞表面疏水性： 三株候选菌均表现出可测量的疏水性，但存在菌株特异性差异，表明其具有与宿主上皮表面相互作用的潜力。

模拟胃肠道条件耐受性： 在酸–胃蛋白酶和胆汁盐–胰蛋白酶两种应激条件下，OD₆₀₀保留率随暴露时间延长总体下降，但PA4和BA4P从第4小时起OD₆₀₀值趋于稳定并略有回升，表明其对长期应激具有适应性耐受；而BA4G在整个暴露期间持续下降。

不同盐度和温度下的生长： 三株菌在10°C–40°C温度梯度和0%–3% NaCl盐度梯度下的生长响应存在菌株特异性差异，PA4和BA4P表现出良好的环境适应性。

酶学和生化活性： PA4对蛋白酶、脂肪酶、脲酶、磷酸酶和淀粉酶呈阳性，纤维素酶阴性；BA4P具有蛋白酶、脂肪酶、脲酶和纤维素酶活性，但未检出淀粉酶和磷酸酶活性；BA4G具有脲酶、纤维素酶、磷酸酶和淀粉酶活性，但蛋白酶和脂肪酶阴性。三株菌均色氨酸酶阴性、氧化酶阳性。此外，三株菌均产生铁载体且具有运动性；PA4为革兰氏阴性且不产孢子，BA4P和BA4G为革兰氏阳性且产内生孢子。

候选菌株筛选与分子鉴定： 基于抗菌活性、安全性、胃肠道耐受性、黏附相关特性和环境适应性等综合筛选，PA4和BA4P被选用于分子鉴定。16S rRNA基因序列分析显示，PA4与铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 多个菌株具有99.93%序列一致性（100%查询覆盖率），鉴定为 Pseudomonas aeruginosa PA4（GenBank登录号：PX766316）；BA4P与 Bacillus sp. 参考序列（FJ785481.1）具有100%序列一致性，并与 Bacillus flexus（Priestia flexa）多个菌株具有99.93%相似性，鉴定为 Bacillus sp. BA4P（GenBank登录号：PX766366.2）。系统发育树中，PA4聚类于铜绿假单胞菌分支，BA4P与 Bacillus sp. 聚为一支。

四、讨论与结论

讨论部分指出，益生菌筛选需整合多种功能性状，单一参数无法可靠预测体内功效。从26株分离株到2株候选菌的显著缩减反映了益生菌筛选的内在选择性，而BA4G尽管早期表现积极但在功能筛选中表现较低而被排除，凸显了功能性稳健性作为决定性标准的重要性。PA4的广谱抗菌活性与其属特异性机制相关，包括铁载体产生和次级代谢物合成；铁载体介导的铁螯合是限制水生系统中病原菌增殖的成熟机制。关于 P. aeruginosa 的鉴定，研究人员强调需要谨慎考虑其机会性致病性，但本研究中PA4的非溶血表型、抗生素敏感性和体内安全性提示其为非毒力菌株，仍需进一步分子表征。BA4P的 Bacillus 分类与其功能稳健性一致，内生孢子形成提供了对环境应激和加工条件的抵抗力，其酶学和抗菌特性与 Bacillus 属已确立的益生菌机制相符，包括酶分泌和脂肽/细菌素产生。PA4和BA4P的分类身份反映了互补的功能策略：竞争性抗菌活性（Pseudomonas）和环境适应性及营养贡献（Bacillus）。独立饲养试验已证实，膳食补充PA4和BA4P显著改善了红罗非鱼的生长性能、肠道健康、免疫反应和抗病能力。

研究结论为：本研究通过系统的多标准筛选策略，从健康红罗非鱼肠道菌群中鉴定出两株有前景的候选益生菌——Pseudomonas aeruginosa PA4和 Bacillus sp. BA4P。两株菌均表现出对主要鱼类病原菌的广谱拮抗活性、以非溶血行为、抗生素敏感性和体内安全性评价支持的良好安全性，以及与益生菌潜力一致的功能特性。研究证明，基于表型的综合筛选策略可有效鉴定水产养殖的宿主相关益生菌候选菌株，为红罗非鱼物种特异性益生菌开发奠定了基础。然而，仍需进一步分子表征（包括毒力相关基因和抗生素耐药基因评估）以全面确立所选菌株的生物安全性，方可进行大规模应用。