面向3D心肌组织工程与心脏纤维化建模的导电、压电及各向异性水凝胶平台

《FEBS Open Bio》：Hydrogel platforms for 3D cardiac tissue engineering and fibrotic disease modelling

　　

组织工程通过构建能够在健康与疾病状态下再现心肌生理特征的体外（in vitro）模型，为加深对心脏疾病的理解和治疗提供了重要潜力。具体而言，基于水凝胶的系统因能够支持细胞活力并模拟细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的部分特征，已被广泛用于构建3D心脏组织。然而，传统水凝胶本质上是各向同性的且电绝缘，限制了其再现天然心肌各向异性结构和导电特性的能力。为克服这些局限，研究人员开发了日益复杂的水凝胶平台，通过引入导电、压电和/或取向结构来增强电耦合、引导组织组织化并促进心肌细胞（cardiomyocytes, CMs）成熟。这些基于水凝胶的系统也可被调控以再现病理状态。心脏纤维化以组织硬度增加为特征，研究人员试图通过调节机械微环境诱导纤维化表型来模拟这一过程。借助近期开发的水凝胶平台，机械性能可在空间和时间上精确控制，从而能够系统研究动态和异质性硬度如何影响组织形成、重塑和疾病进展。尽管这些平台尚未完全实现转化，但它们提供了强大的工具，可调节多种生理参数，从而增进对心脏发育的理解，并为治疗常见病理状况提供策略。

Overview of 3D in vitro human cardiac models：早期体外心脏模型多采用二维（2D）单层培养的诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CMs），现有分化方案通过中胚层诱导、心脏中胚层特化与CM成熟等阶段模拟早期胚胎发育，其中Wnt/β-catenin信号时序调控是主流策略，如GiWi方案以GSK3抑制剂CHIR99021促进中胚层形成，继以IWP2或IWR1抑制Wnt以诱导心脏特化，所得CMs多为未成熟胎儿样心室CMs。电刺激（1–6 Hz）和机械加载可改善排列、闰盘、缝隙连接、肌原纤维组织与收缩功能，Biowire II平台可产生更成熟表型。2D单层缺乏3D结构、多细胞相互作用和ECM线索，因此共培养模型引入成纤维细胞、内皮细胞和基质细胞以重建旁分泌与细胞间相互作用，并提高CM成熟、电耦合、收缩力和长期稳定性。3D系统分为依赖细胞自组装的无支架系统和以生物材料提供结构支持的有支架平台。

Scaffold-free techniques：无支架3D心脏类器官通过细胞自组装形成多细胞聚集体，如拟胚体（embryoid bodies, EBs）和心脏球体，常采用悬滴、旋转悬浮、非黏附模具或低黏附板。EBs可由多能干细胞经分阶段分化形成，先进方案在中胚层诱导时加入BMP4和Activin A，或在心脏特化时加入BMP、VEGF和FGF，以获得含CMs、成纤维细胞和内皮细胞的多谱系类器官。3D聚集体内氧、营养和机械张力梯度可促进空间异质性谱系特化和组织组织化，并形成心肌样腔隙及心内膜/心肌/心外膜样分层。心脏球体则由预分化细胞形成，较EBs更易控制细胞组成和重复性，可用于系统研究细胞间相互作用。但无支架系统对力学性能和ECM组成的控制有限。

Scaffolded techniques：有支架技术将细胞包封于生物材料支架，最常用聚合物水凝胶。水凝胶为水溶胀交联网络，含羧基、酰胺、氨基和羟基等亲水基团，可模拟天然组织水合与黏弹性；天然或改性ECM来源水凝胶包括纤维蛋白、胶原、透明质酸（HA）和明胶，常含RGD、YIGSR等生物活性基序以促进整合素介导黏附；藻酸盐和壳聚糖缺乏固有细胞黏附基序。合成水凝胶如PEG、PVA、PLA和PLGA可精确控制刚度、降解和网络结构，但通常需功能化细胞黏附配体。水凝胶通过物理或化学交联稳定：物理交联包括氢键、离子作用和疏水缔合，如Ca²⁺与藻酸盐羧酸基团配位；化学交联形成共价键，可通过酶反应、点击化学、Michael加成和自由基聚合实现。天然聚合物常经化学修饰引入反应基团，如硫醇化PEG/HA参与Michael加成或硫醇-烯点击反应，甲基丙烯酸酯化HA（HAMA）和明胶（GelMA）可经热、紫外（UV）或可见光交联。2002年新生大鼠CMs被成功包封于纤维蛋白凝胶，此后GelMA、明胶–藻酸盐、HA–明胶、胶原–Matrigel、PEG和PEG–纤维蛋白原等体系被用于构建心脏组织；2D预培养后转入3D明胶水凝胶的iPSC-CMs表现出更佳组织化、肌节排列和收缩蛋白表达。

Optimising the hydrogel system for cardiac tissue：天然心肌具有高度有序的层状结构，CMs排列赋予显著电学和力学各向异性，ECM胶原纤维网络提供取向线索。多数水凝胶各向同性且电绝缘，因此复合水凝胶引入导电、压电或结构组分以增强电信号、提供各向异性引导并重建心肌微环境。

Conductive hydrogel systems：导电复合水凝胶主要引入导电聚合物（PPy、PANi、PEDOT）、碳基纳米材料（CNT、氧化石墨烯）和金属纳米颗粒（金纳米颗粒、金纳米线）。PPy因相对生物相容性和易整合而被广泛用于HA、胶原、PLA和藻酸盐水凝胶；5 wt% PPy可使GelMA–藻酸盐水凝胶电导率由0.0615增至0.124 Scm^?1。PEDOT:PSS胶原–藻酸盐水凝胶可增强CM成熟、电耦合和传导相关基因表达。CNT-GelMA心脏补片促进结构组织、同步收缩和细胞间耦合；聚多巴胺修饰还原氧化石墨烯-GelMA改善CM活力、排列和同步搏动。GelMA包覆金纳米棒（GNR）加入GelMA/藻酸盐生物墨水可改善细胞间耦合、同步收缩和收缩频率。

Piezoelectric hydrogel systems：压电水凝胶复合材料将机械变形转化为局部电信号，实现机械电耦合。PVDF和PVDF-TrFE可以纤维或电纺网络形式提供机械加载响应性电线索，PVDF-TrFE纤维支架支持干细胞来源CMs排列、自发收缩和心脏特异性成熟。PVDF与导电石墨烯复合可兼具压电和电功能，并增强结构组织化和肌节α-actinin表达。PVDF/PCL微纤维及磁性PCL/Fe₃O₄复合材料可用于外部控制变形；在压电构建体中接受循环机械刺激的CMs表现出更佳成熟、肌节组织和钙处理。压电陶瓷纳米颗粒如BaTiO₃也可掺入水凝胶，PEO/丝素蛋白/BaTiO₃复合材料具有压电性和心脏细胞相容性；机械环境变化可进一步转化为电刺激变化，对纤维化建模具有潜在意义。

Anisotropic hydrogel systems：为重建心肌各向异性，早期采用电纺制备PLGA、PMGI和PCL等取向纤维促进CM排列，并与水凝胶整合以将结构引导延伸至3D。明胶–藻酸盐水凝胶中剪切诱导明胶纤维取向可引导人CMs自组织为各向异性肌肉样组织；GelMA中嵌入PCL/丝素蛋白/CNT纳米纤维纱可增强CM伸长、排列和成熟。PCL碎片/HAMA体系可独立调控纤维密度和长度并促进各向异性微组织形成。熔融静电纺丝（MEW）制备的PCL微纤维晶格与纤维蛋白或GelMA水凝胶结合，可精确控制纤维结构，促进CM排列、各向异性收缩和电传播。Filamented Light生物制造通过数字光处理（DLP）在块体水凝胶中生成取向纤维微凝胶结构，引导CM伸长和组织化，并可调节刚度和降解性；双光子聚合可实现纳米尺度几何控制；颗粒水凝胶通过组装微凝胶构建各向异性结构。

Controlling the mechanical properties of hydrogels：机械微环境通过机械转导调控细胞发育、分化和健康/疾病表型，心肌纤维化中刚度由约10 kPa增至50–100 kPa，且具有动态和空间异质性。水凝胶可通过聚合物浓度调控刚度，如GelMA由5%增至15% wt/v使杨氏模量由1.2增至41.8 kPa，HAMA由1%增至5%使杨氏模量由3.5增至24 kPa，但会同时改变孔隙率和扩散性。更常用策略是调控交联密度：GelMA功能化度（DoF）由28%增至91%可使杨氏模量由3.8增至29.9 kPa；藻酸盐中Ca²⁺浓度由21.8 mm增至40.5 mm可使刚度由11增至21 kPa；丝素蛋白辣根过氧化物酶（HRP）交联中H₂O₂浓度可调刚度约0.1–1.5 kPa。光交联水凝胶可通过光引发剂浓度、光照时间和强度调节刚度。粘弹性可通过可逆物理或动态共价交联调控，藻酸盐离子交联可独立调节弹性与应力松弛，降低分子量或引入PEG间隔基可加速松弛；藻酸盐–胶原互穿网络及DBCO功能化藻酸盐–明胶水凝胶可调控应力松弛，合成PEG水凝胶可独立控制刚度、松弛和降解。

Spatial control of hydrogel mechanics：机械梯度是细胞行为的重要调节因素，健康心肌与纤维化瘢痕间存在约10 kPa·mm^?1的刚度梯度并驱动durotaxis，心脏成纤维细胞可向更硬区域定向迁移。空间控制刚度主要依赖空间调控交联密度，如多喷头3D打印沉积不同比例高/低DoF GelMA后均匀UV交联；亦可通过Ru光引发剂扩散形成线性刚度梯度，使脱细胞ECM杨氏模量在3.5 mm内由460降至20 kPa。DLP结合数字微镜器件（DMD）可通过光强投影实现更高分辨率图案化，在GelMA中形成刚度“柱”以促进细胞排列，并可创建尖锐刚度转变或毫米尺度生理相关梯度，用于研究成纤维细胞机械转导和迁移。

Geometric control of hydrogels：光图案化投影系统可控制水凝胶几何结构，光交联和光降解水凝胶可形成微沟槽、通道和各向异性结构。光降解GelMA微通道促进CM排列、组织化和规律搏动；含iPSC-CMs的微图案GelMA水凝胶中，20 μm宽沟槽与20 μm间隔可促进细胞和F-actin排列、增加connexin-43和vinculin表达、延长肌节并增强收缩各向异性。DMD可直接将含CMs的GelMA生物打印为平行线结构，使CMs沿打印几何优先伸长和排列。

Temporal control of hydrogel mechanics：时间可调水凝胶用于模拟发育、愈合和疾病中的动态力学变化。提高刚度常依赖二次交联，如GelMA部分光聚合后再次照射；GelMA–藻酸盐水凝胶先经离子交联稳定，再光聚合GelMA相实现按需硬化，杨氏模量由1增至18 kPa；硫醇-烯PEG水凝胶可经二次光交联由0.24增至13 kPa。软化可通过光降解或酶切实现，o-nitrobenzyl光不稳定交联剂经UV照射可使藻酸盐–聚丙烯酰胺水凝胶刚度由约56 kPa降至约15 kPa；含MMP和凝血酶敏感位点的PEG肽交联剂可经酶切使刚度由6.3降至1.2 kPa。可逆调控体系包括氧化甲基丙烯酰化藻酸盐（OMA）通过Ca²⁺添加和EDTA螯合实现反复硬化/软化；磁性水凝胶可无线可逆调节刚度；偶氮苯聚丙烯酰胺水凝胶可在蓝光和绿光下可逆切换刚度。

Previous fibrotic models：心脏纤维化以ECM过度沉积和心肌进行性硬化、成纤维细胞向肌成纤维细胞转变为特征。体外纤维化模型通过调控细胞组成、杨氏模量、缺氧和生化刺激诱导成纤维细胞活化。TGF-β是最常用生化诱导剂，多糖水凝胶中2.5 nm TGF-β、GelMA中共培养（0.5 nm）、纤维蛋白凝胶（10 nm）和心脏球体（10 nm）均可上调α-SMA、纤连蛋白和胶原等肌成纤维细胞标志物并降低CM收缩力。缺氧和去甲肾上腺素可使多细胞类器官出现成纤维细胞活化、纤维化相关基因上调和组织刚度增加；CoCl₂诱导CM死亡可上调心脏球体纤维化相关基因。增加成纤维细胞比例超过50%可提高胶原I沉积、降低收缩力和搏动频率；纤维蛋白Biowire中CM:成纤维细胞由3:1变为1:3可使组织刚度由约7.6增至约61.1 kPa，并伴肌成纤维细胞活化、肌原纤维组织紊乱、connexin分布改变、收缩动力学延长和收缩力下降。机械线索通过机械转导强化肌成纤维细胞表型，胶原–藻酸盐、GelMA和PEG水凝胶均显示刚度依赖性成纤维细胞–肌成纤维细胞转变。动态软化可逆转肌成纤维细胞转变，如光降解PEG水凝胶由32降至7 kPa可使瓣膜肌成纤维细胞转向静息表型；胶原–藻酸盐水凝胶先硬化至约20 kPa再软化至1 kPa可降低α-SMA、vinculin和paxillin表达。空间刚度梯度可诱导成纤维细胞沿约12 kPa·mm^?1梯度向硬区迁移并呈±45°排列。粘弹性亦影响CM和成纤维细胞行为，纤维化球体显示更快应力松弛；DBCO功能化双交联藻酸盐–明胶水凝胶可在弹性模量变化较小情况下调控应力松弛。微柱平台通过改变柱刚度和几何为收缩性心脏组织提供机械边界，PEGDA微柱和PDMS柱可影响CM成熟、肌节组织、病理相关基因表达、BNP分泌及肥大/纤维化标志物。

Outlook and conclusion：水凝胶平台已从2D iPSC-CM单层发展为具有可调力学和复杂结构的复合体系，但仍需整合导电性、结构各向异性和动态可调性以更完整再现成熟心肌。DLP、双光子聚合、体积生物打印和MEW等先进生物制造技术有望在微观和宏观尺度精确控制3D结构与力学。当前水凝胶体系受扩散限制，通常为小而薄的构建体，高细胞密度下易形成缺氧或坏死核心，因此诱导血管化对构建更厚、层状心肌组织及研究纤维化中片层相互作用至关重要。iPSC-CMs的成熟度和表型稳定性仍是主要挑战，未来需结合2D分化方案、3D成熟策略及在3D水凝胶中直接分化，并引入各向异性、电刺激和机械加载等生物物理线索以促进结构组织和功能成熟。