NSG-ApoEKO免疫缺陷小鼠：一种新型人源化动脉粥样硬化小鼠模型

《The FASEB Journal》：NSG Mice Lacking Apoe: An Immunodeficient Mouse Model of Atherosclerosis

　　

关于动脉粥样硬化的鼠类研究主要在C57BL/6（B6）品系背景下进行，最常用的是B6.129P2-Apoetm1Unc/J（B6-ApoEKO）品系。由于人类和小鼠免疫系统之间存在固有的物种差异，使用B6背景品系限制了免疫疗法开发的可转化性。针对这一局限性的一个拟议解决方案是建立一种能够支持人淋巴样和髓样细胞群体植入的人源化动脉粥样硬化小鼠模型。这类模型的开发一直受到缺乏既能发展动脉粥样硬化又能支持人免疫细胞植入的小鼠品系的阻碍。在本论文中，研究人员报道了一种NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/Sz（NSG）免疫缺陷小鼠品系，该品系在Apoe基因中存在一个383 bp的缺失，阻止了ApoE蛋白的表达。当维持在高脂饮食下时，NSG-ApoEKO小鼠会发展出与B6-ApoEKO小鼠水平相似的高胆固醇血症和动脉粥样硬化。尽管B6-ApoEKO小鼠的动脉粥样硬化已在许多实验室、多种条件下得到广泛研究，但研究人员对NSG-ApoEKO小鼠疾病的初步研究是有限的，未来有必要与B6-ApoEKO小鼠进行比较研究。NSG-ApoEKO小鼠在发展动脉粥样硬化的同时，也能支持人细胞植入，从而使其可用于研究人类特异性的免疫方面。

论文解读文章

研究背景、现存问题与研究目的

动脉粥样硬化是一种由脂质驱动的中型及大型血管慢性炎症性疾病。鉴于其炎症性质，靶向免疫系统治疗该病的研究兴趣日益增长，然而尚未出现突破性疗法，这在一定程度上归因于缺乏用于开发和测试这些免疫疗法的预测性临床前模型。目前大多数动物模型研究均使用免疫功能健全的小鼠，尤其是基于C57BL/6（B6）背景的ApoE^KO或LDLR^KO品系。虽然这些模型提供了大量病理学信息，但由于小鼠与人类免疫系统间固有的物种差异，它们在临床可转化性方面存在缺口。填补此缺口的潜在方案是利用严重免疫缺陷小鼠构建人源化免疫系统小鼠模型，使其能够植入人类免疫细胞和组织。然而，此前开发的NOD背景（NSG小鼠的亲本品系）的ApoE^KO或LDLR^KO小鼠被证实对动脉粥样硬化具有抵抗性，无法形成斑块。因此，迫切需要一种既能在高脂饮食诱导下发展动脉粥样硬化，又能支持人类免疫细胞高效植入的新型小鼠模型，以桥接基础研究与临床应用之间的鸿沟。

研究方法与技术路线

本研究的主要技术方法包括：1）利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在NSG小鼠中靶向Apoe基因外显子3，创建了具有383 bp缺失的NSG-ApoE^KO品系；2）采用聚合酶链式反应（PCR）和测序验证基因型，并通过毛细管自动Western blot（Simple Western）确认ApoE蛋白表达的缺失；3）对4周龄小鼠施以高脂饮食（HFD，42%千卡来自脂肪）处理10至28周以诱导疾病；4）采集血清并使用生化分析仪进行脂质谱检测；5）通过组织学染色（苏木精-伊红H&E、马森三色MTC、油红O）及自动免疫组化（IHC）评估主动脉根部和全主动脉的斑块负荷、胶原含量及免疫细胞浸润情况；6）对人脐带血来源的CD34⁺造血干细胞（HSC）进行移植实验，以评估小鼠支持人源细胞植入的能力。

研究结果

3.1 NSG-ApoE^KO小鼠携带Apoe基因外显子3的383 bp缺失，阻止ApoE表达

通过CRISPR-Cas9靶向，研究人员获得了一个携带383 bp缺失的雌性NSG创始人小鼠，该缺失移除了整个Apoe基因的外显子3。由此建立的两种品系（L1和L2）经PCR验证均缺乏Apoe基因，Simple Western分析也证实这两种品系均不产生ApoE蛋白。

3.2 NSG-ApoE^KO小鼠在HFD喂养8周和28周后均发展出高胆固醇血症

与NSG对照相比，NSG-ApoE^KO小鼠的总胆固醇升高约10倍，低密度脂蛋白（LDL）升高约30倍。出乎意料的是，与经典的B6-ApoE^KO模型相比，NSG-ApoE^KO小鼠在HFD喂养8周后表现出显著更高的总胆固醇和甘油三酯水平；在28周后，其LDL和高密度脂蛋白（HDL）水平也显著高于B6-ApoE^KO小鼠。这表明NSG-ApoE^KO小鼠成功克服了NOD背景的动脉粥样硬化抗性，并展现出比预期更严重的血脂异常表型。

3.3 动脉粥样硬化斑块在NSG-ApoE^KO小鼠的主动脉根部形成

经过28周的HFD喂养，所有NSG-ApoE^KO和B6-ApoE^KO小鼠的主动脉根部均出现了动脉粥样硬化斑块，而NSG对照组则未见斑块。形态学上，两种品系的斑块相似，均含有早期坏死核心中的胆固醇裂隙和纤维帽。斑块面积占管腔的百分比在两组间无显著差异。然而，一个关键区别在于斑块的胶原含量：NSG-ApoE^KO小鼠斑块中胶原占比约为35%，而B6-ApoE^KO小鼠则接近60%。斑块内巨噬细胞（CD68⁺）和血管平滑肌细胞（α-SMA⁺）的分布模式在两种品系中表现相似。

3.4 雄性和雌性NSG-ApoE^KO与B6-ApoE^KO小鼠之间的血脂差异

在HFD喂养28周后，NSG-ApoE^KO雄性小鼠的总胆固醇和LDL水平显著高于雌性小鼠，这一性别差异在B6-ApoE^KO或NSG品系中未观察到。所有三种品系的雌性小鼠HDL水平均显著低于雄性。在斑块面积方面，仅在B6-ApoE^KO品系中观察到雄性显著大于雌性，而在NSG-ApoE^KO品系中未见此差异。

3.5 ApoE缺失影响NSG小鼠肝脏和皮肤形态

在HFD喂养28周后，NSG-ApoE^KO小鼠的肝脏形态相对正常，而NSG小鼠表现为微泡性脂肪变性，B6-ApoE^KO小鼠则以大泡性脂肪变性为主，均未观察到明显纤维化。此外，NSG-ApoE^KO小鼠的耳部皮肤显示出慢性炎症迹象，伴有单核细胞浸润和真皮表皮增厚，主要由巨噬细胞（F4/80⁺）构成，这与B6-LDLR^KO小鼠的表型相似。

3.6 NSG-ApoE^KO小鼠支持人细胞植入

移植了人CD34⁺ HSC的NSG-ApoE^KO小鼠，在移植13周后，其脾脏中可检测到人CD45⁺细胞。更重要的是，这些移植后的小鼠在接受HFD喂养14周后，其血脂水平和平均斑块面积与注射盐水的对照组相比无显著差异，表明人源细胞的植入并未干扰动脉粥样硬化的发展进程。

讨论总结与研究结论

讨论部分总结： 本研究的核心发现是，尽管NOD背景小鼠此前被认为对动脉粥样硬化具有抵抗性，但在此基础上构建的严重免疫缺陷NSG-ApoE^KO小鼠却能够发展出与经典B6-ApoE^KO模型相似的动脉粥样硬化。这一矛盾现象暗示，NOD小鼠的动脉粥样硬化抵抗性可能由其功能尚存的适应性或先天性免疫所介导，而这些免疫功能在NSG小鼠中因Prkdc^scid和Il2rg^tm1Wjl突变而被严重削弱或消除。研究者指出，关于适应性免疫在动脉粥样硬化中是促进还是保护作用，既往研究结论不一，这可能与小鼠品系背景（如B6 vs. BALB/c）、动物年龄、饲养环境（特别是病原体暴露状态）等多种因素有关。本研究的优势在于使用了严格控制的屏障设施，排除了特定病原体的干扰。此外，NSG-ApoE^KO小鼠还表现出一些独特的器官表型，如肺部肺泡巨噬细胞增多和肝脏免受脂肪变性，这些现象值得进一步探索。

研究结论： 研究人员报告了一种NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/Sz（NSG）免疫缺陷小鼠品系，该品系在Apoe基因中存在一个383 bp的缺失，阻止了ApoE蛋白的表达。当维持在高脂饮食下时，NSG-ApoE^KO小鼠会发展出与B6-ApoE^KO小鼠水平相似的高胆固醇血症和动脉粥样硬化。NSG-ApoE^KO小鼠在发展动脉粥样硬化的同时，也能支持人细胞植入，从而使其可用于研究人类特异性的免疫方面。