《Letters in Drug Design & Discovery》：Circadian rhythm disruption-related genes as potential diagnostic biomarkers in diabetic nephropathy: Integrated transcriptomic, single-nucleus, and molecular docking analyses
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**摘要**
**背景**：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要微血管并发症。昼夜节律紊乱（circadian rhythm disruption，CRD）已被认为与DN相关，但CRD相关的诊断生物标志物及其潜在的生物学
**摘要**
**背景**：糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的主要微血管并发症。昼夜节律紊乱（circadian rhythm disruption，CRD）已被认为与DN相关，但CRD相关的诊断生物标志物及其潜在的生物学相关性尚未完全阐明。
**目的**：本研究旨在识别DN中与CRD相关的候选诊断生物标志物，表征其细胞分布和体外功能相关性，并通过计算手段探索与所选靶点相关的潜在化合物。
**方法**：从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取DN转录组数据集。进行差异表达分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）以识别CRD相关基因。采用蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析和跨数据集表达比较来筛选核心基因并构建诊断模型。进行免疫浸润和单核分析以探究其潜在的生物学相关性和细胞分布。检测核心基因在高糖处理的HK-2细胞中的表达和功能效应。采用分子对接和分子动力学模拟评估Grapiprant与CXCR4之间的潜在相互作用。
**结果**：ICAM1、CCL20和CXCR4被确定为候选诊断生物标志物，并整合到诊断模型中，该模型在GSE142153中的曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.896，在GSE30529中的探索性AUC为0.958。由于GSE30529参与了候选基因的选择，后一估计值不被视为独立的外部验证。核心基因与免疫细胞评分以及与转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号传导、炎症和凋亡相关的通路有关。体外实验证实了它们在高糖处理的HK-2细胞中的表达改变和功能相关性。单核分析确定了九个主要细胞簇，并显示在注释的浆细胞亚群中CXCR4表达相对升高。分子对接和分子动力学模拟预测了Grapiprant与CXCR4之间的潜在相互作用。
**结论**：ICAM1、CCL20和CXCR4可能作为DN中与CRD相关的候选诊断生物标志物。然而，这些发现受到公共队列样本量小、缺乏直接昼夜节律测量和独立的组织水平验证，以及预测的Grapiprant-CXCR4相互作用的计算性质等限制。因此，需要在更大的队列和实验模型中进行进一步验证。
**昼夜节律紊乱相关基因作为糖尿病肾病潜在诊断生物标志物：整合转录组学、单核与分子对接分析**
**一、研究背景与科学问题**
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是糖尿病患者死亡的主要原因。DN的病理特征包括肾小球结构和功能异常、肾损伤、滤过能力丧失及蛋白尿，其发病机制复杂，涉及炎症反应、肠道菌群失调及代谢紊乱等多重因素。近年研究发现，昼夜节律在维持肾脏正常功能中发挥关键作用，包括肾小球滤过效率和肾小管重吸收能力均受细胞昼夜节律机制的调控。昼夜节律紊乱（circadian rhythm disruption，CRD）不仅与糖脂代谢异常密切相关，还可能参与DN的发生发展。然而，CRD相关的诊断生物标志物及其在DN中的潜在生物学机制尚未充分阐明。因此，识别CRD相关诊断标志物并阐明其生物学功能，对于DN的早期诊断和机制研究具有重要意义。
**二、研究设计与技术方法**
研究人员基于基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取三个公共转录组数据集：GSE142153作为发现队列，包含外周血样本（10例健康对照、23例DN、7例终末期肾病）；GSE30529作为探索队列，包含肾小管样本（10例糖尿病肾病、12例健康对照）；GSE131882包含单核RNA测序数据（3例早期糖尿病肾病、3例对照）。主要技术方法包括：（1）利用limma包进行差异表达分析，结合单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）计算CRD评分；（2）加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）鉴定CRD相关模块；（3）蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析结合cytoHubba和MCODE算法筛选核心基因，经跨数据集表达方向一致性比较后构建诊断模型；（4）ssGSEA评估28种免疫细胞浸润；（5）单核RNA测序分析表征候选基因的细胞类型特异性分布；（6）体外实验采用高糖处理的人肾近端小管上皮细胞（HK-2）进行基因沉默功能验证；（7）分子对接和分子动力学模拟预测候选化合物与靶蛋白的相互作用。
**三、主要研究结果**
**1. CRD相关基因的鉴定与富集分析。** 在GSE142153中筛选出354个差异表达基因（162个上调，192个下调）。DN组的CRD评分显著高于对照组。WGCNA鉴定出棕色和品红色模块与CRD评分显著正相关，共获得700个模块基因，与差异表达基因取交集后得到100个CRD相关差异表达基因。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析显示肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信号通路显著富集；基因本体论（Gene Ontology，GO）分析显示白细胞迁移为最显著富集的生物学过程，细胞因子受体结合为最显著富集的分子功能。
**2. 候选核心基因鉴定与诊断模型构建。** 通过PPI网络分析，cytoHubba的MCC算法和MCODE算法交叉整合得到9个候选核心基因。跨数据集表达比较显示，仅ICAM1、CCL20和CXCR4在GSE142153和GSE30529中表达方向一致上调，被保留为候选诊断生物标志物。基于这三个基因构建的诊断模型在GSE142153中AUC为0.896，在GSE30529中探索性AUC为0.958。由于GSE30529参与了候选基因筛选，该结果不能视为独立外部验证。
**3. 核心基因与免疫紊乱及通路异常的关系。** 随着疾病从正常状态进展到DN再到终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD），核心基因与T细胞、浆细胞样树突状细胞、单核细胞等免疫细胞的相关性发生显著变化，从正相关逐渐转向强负相关。同时，核心基因与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、TGF-β、炎症反应、凋亡、缺氧等信号通路的相关性随疾病进展逐渐增强。
**4. 体外功能验证。** 在高糖处理的HK-2细胞中，qRT-PCR证实ICAM1、CCL20和CXCR4表达发生改变。分别沉默三个基因后，细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平发生改变，高糖诱导的细胞凋亡得到缓解，CCK-8检测的代谢活力得到恢复。这些结果表明三个核心基因可能参与高糖暴露下的细胞应激反应。
**5. 单核RNA测序分析。** 对GSE131882进行单核分析，质控后保留23,970个细胞核，注释出九个主要细胞簇：表达CFH的细胞簇、集合管细胞、足细胞、内皮细胞、远端曲小管细胞、系膜细胞、白细胞、髓袢细胞和近端曲小管细胞。DN样本中白细胞比例高于对照。ICAM1在内皮细胞和CFH表达簇中高表达，CXCR4主要在白细胞中检测到，CCL20在各细胞簇中表达相对稀疏。进一步对白细胞亚群再聚类，鉴定出B细胞、T细胞、单核细胞和浆细胞四个亚群，CXCR4在浆细胞亚群中表达相对升高。
**6. 分子对接预测Grapiprant与CXCR4的潜在相互作用。** 基于CXCR4相关基因集的功能富集分析显示，这些基因主要富集于内质网应激相关生物学过程。网络药物-疾病邻近度分析筛选出候选化合物Grapiprant。分子对接预测Grapiprant占据CXCR4的经典配体结合口袋，最优结合能为?7.8 kcal/mol。分子动力学模拟结果显示复合物在80 ns内保持相对稳定，蛋白-配体质心距离维持在3.2–3.8 nm范围。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，昼夜节律在肾脏功能调控中发挥重要作用，Bmal1敲除可显著改变小鼠肾功能及相关基因表达。ICAM1作为细胞表面糖蛋白和黏附受体，其上调表达与糖尿病患者尿白蛋白增加密切相关；CCL20通过与其受体CC趋化因子受体6（CC chemokine receptor 6，CCR6）相互作用参与免疫调节和炎症反应，在DN中促进Th1和Th17细胞招募；CXCR4/CXCL12轴在肾脏系统发育和恢复中发挥双重调控作用。体外实验支持三个基因参与DN相关细胞损伤的潜在机制，包括ROS介导的氧化应激、细胞凋亡和代谢活力改变。单核分析揭示了候选基因的细胞类型特异性表达模式，提示其可能通过不同细胞群参与DN病理过程。
研究结论：通过整合转录组分析，ICAM1、CCL20和CXCR4被鉴定为DN中CRD相关的候选诊断生物标志物。高糖处理的HK-2细胞体外实验支持它们参与氧化应激、凋亡和代谢活力的调控，单核分析提示其在肾组织中的细胞类型特异性表达模式，分子对接和分子动力学模拟进一步预测了Grapiprant与CXCR4之间的潜在相互作用。然而，这些基因的诊断价值需要在未参与候选基因选择的更大规模独立队列中进一步验证，预测的Grapiprant-CXCR4相互作用也需要实验验证。
