含抗坏血酸聚（碳酸酯-抗坏血酸）聚氨酯（PCAU）共混微孔支架的抗氧化生物活性及其在组织工程心脏瓣膜（TEHV）支架开发中的应用

《Journal of Biomedical Materials Research Part A》：An Ascorbic-Acid Containing Poly(Carbonate) Urethane With Antioxidant Bioactivity for Application in Heart Valve Scaffold Development

　　

人工心脏瓣膜开发包含若干分支创新策略，以调控导致瓣膜耐久性下降的复杂天然环境。抗钙化处理正应用于心包组织；耐久性聚合物正被开发以减轻氧化降解和应力开裂；心脏瓣膜组织工程已引入可吸收支架，其可发展为稳定、功能性组织。每种策略均在拓展以遏制瓣膜退化这一持续问题。本研究旨在合成并表征一种含抗坏血酸的聚氨酯，以赋予可降解支架抗氧化特性，用于组织工程心脏瓣膜（TEHV）替代。将聚（碳酸酯-抗坏血酸）聚氨酯（PCAU）与聚（碳酸酯聚氨酯）脲（PCUU）的共混物制成微孔支架，以评估PCAU在体外对力学、降解、细胞活力、钙化、细菌黏附的影响，以及在幼年大鼠皮下模型中对天然组织反应的体内影响。PCAU与PCUU以25:75比例共混（PCAU-25）的力学性能与PCUU相似；更高PCAU浓度的共混物力学性能不稳健。PCAU-25在体外显示更强的活性氧（ROS）抑制和降解，并减少钙化和细菌黏附。在幼年大鼠皮下模型中，PCUU和PCAU-25组4周后钙化均可忽略。然而PCAU-25显示远高于PCUU的细胞浸润和免疫反应，可能由于降解速率加快。随后PCAU-25被制成聚合物瓣膜支架，并进行基本力学和水动力学性能评估，显示其功能与先前报道的PCUU瓣膜相似。这些发现证明一种新聚氨酯配方的概念验证，该配方整合抗坏血酸以获得抗氧化生物活性，并可转化为功能性TEHV支架。

心脏瓣膜替代物虽带来明确获益，但耐久性不足仍是核心问题。生物假体心脏瓣膜（BHV）的寿命不足尤为突出，尤其在年轻患者经导管置入BHV趋势增加背景下，结构性瓣膜退化（SVD）是关键缺陷。现有抗钙化处理可改善BHV寿命但不能消除钙化诱导的SVD；同种移植物长期表现较好但可用性有限；耐久性聚合物瓣膜（DPV）早期失败，近期聚氨酯软段化学和异丁烯基化学显示希望；组织工程心脏瓣膜（TEHV）在天然或合成聚合物基础上取得迭代进展，但合成与天然聚合物TEHV仍在6和12个月观察到钙沉积，尽管低于传统生物假体对照。钙化涉及多机制交互，氧化应激被认为参与启动和传播心血管组织骨化；BHV因固定生化与力学性质，其钙化机制可能放大，未缓解的氧化应激可能是贡献因素；DPV缺乏生物成分曾被设想可防钙化与SVD，但氧化应激与环境应力开裂共同导致意外钙化和SVD，因此低氧化易感性新配方正在开发。抗坏血酸是自由基清除剂，可保护细胞成分免受氧化应激并支持细胞增殖，且可促进主动脉瓣间质细胞体外胶原沉积、铺展和细胞数量。研究人员既往发现可降解PCUU用于TEHV时血栓倾向低、力学与微结构可调。基于此，研究人员旨在合成含抗坏血酸链段的PCAU，制备并评价电纺PCAU三叶瓣心脏瓣膜支架的物理化学性质，评价其体外细胞相容性、血液相容性及抗氧化效应，并在幼年大鼠皮下模型中评价微纤维PCAU支架的体内钙化和免疫反应。研究结论是PCAU需与PCUU共混以补足力学稳定性；PCAU-25保留与PCUU相似力学和微结构，并具更强ROS抑制、降解、抗钙化和抗细菌黏附，体内钙化可忽略但细胞浸润和免疫反应更高，且可制成功能表现与既往PCUU瓣膜相似的TEHV支架，为抗氧化聚氨酯用于心脏瓣膜替代提供概念验证。

关键技术与方法概述（≤250字）：研究人员以聚六亚甲基碳酸酯二醇、1,4-二异氰酸丁烷和抗坏血酸扩链合成PCAU，用¹H-NMR和特性黏度表征；制备PCAU:PCUU共混浇铸膜行单轴拉伸筛选PCAU-25；静电纺丝制备微纤维片和瓣膜支架；用DPPH法测ROS抑制，脂肪酶/酯酶测降解，羊血测血小板沉积，金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 6538-GFP测细菌黏附，NIH 3T3、rSMC、rEC测细胞活力，rSMC加CaCl₂/H₂O₂测钙沉积；使用12只4周龄、45–50 g雄性Sprague–Dawley大鼠（Inotiv Inc.）行皮下植入4周，做组织学与免疫组化；瓣膜支架行单/双轴力学和脉冲复制器水动力评价。

研究结果：
3.1 PCAU的合成：通过¹H-NMR检测到抗坏血酸特征质子峰，确认其并入聚合物主链；由峰面积比较得到PC:BDI:AA组成比0.47:1:0.53；PCAU特性黏度为0.82，PCUU为1.12。
3.2 PCAU:PCUU共混物的力学特征：通过单轴拉伸至失败评价五种共混物，随PCAU含量增加材料总体变弱；PCAU-25在10%割线模量、极限拉伸强度和断裂应变上与PCUU相似，PCUU和PCAU-25显著强于其他组，PCAU-100断裂应变显著最低，因此选择PCAU-25继续研究。
3.3 PCAU的静电纺丝及其理化性质：电纺制备PCUU和PCAU-25微纤维片，二者平均纤维直径和平均孔径无显著差异；DPPH法显示PCAU-25的ROS抑制为45%±3%，显著高于PCUU的19%±2%；脂肪酶中8周后PCAU-25质量损失?22%±3%，显著大于PCUU的?9%±3%，酯酶中二者质量损失均可忽略。
3.4 体外血小板沉积、细菌黏附、细胞黏附与增殖及钙化研究：羊血LDH法显示PCAU-25血小板沉积约为PCUU的一半；MTS和SEM显示PCAU-25对NIH 3T3、rSMC、rEC的黏附均显著高于组织培养聚苯乙烯（TCPS）；rSMC培养中，PCAU-25在加或不加CaCl₂时钙沉积显著低于PCUU，加CaCl₂和H₂O₂时PCAU-25与PCAU无显著差异且钙沉积量比单加CaCl₂高一个数量级；GFP标记S. aureus实验中，PCAU-25在1 h和24 h的荧光信号均显著低于PCUU。
3.5 幼年大鼠皮下植入后取出样本的组织学评价：H&E显示所有样本均被组织包裹，PCUU边界清晰且细胞浸润少，PCAU-25边界较不清晰，支架内细胞核显著多于PCUU（1100±290 vs. 30±22）；Von Kossa和Alizarin Red显示GLUT广泛钙化，其他三组仅少量微结节；定量钙覆盖GLUT为21%±2.7%，显著高于PCAU-25的0.084%±0.0049%、PCUU的0.029%±0.025%和DECELL的0.0097%±0.0046%，后三组无显著差异且均低于0.1%；免疫组化显示CD68⁺面积分数PCAU-25显著高于其他三组，CD206⁺面积分数GLUT最高，CD86⁺面积分数PCAU-25最高。
3.6 PCAU-25心脏瓣膜支架的制备与评价：PCAU-25瓣膜支架平均瓣叶厚度257±51.2 μm；瓣叶周向样本单轴拉伸10%割线模量1.84±0.375 MPa、极限拉伸强度3.45±1.20 MPa、断裂应变330%±108%；双轴拉伸至250 kPa时最大应变约10%，径向与周向响应接近，呈各向同性；脉冲复制器模拟肺动脉条件（肺动脉压27/10 mmHg、每搏69 mL、心率72 bpm、心输出量4.97 L/min）下瓣叶运动良好，收缩期完全开放，舒张期对合良好且无pinwheeling；平均跨瓣压差2.8±0.77 mmHg，有效开口面积（EOA）3.1±0.81 cm²，反流分数8.4%±1.2%，主要为关闭体积。

讨论部分总结：作者指出，尽管抗坏血酸抗氧化性已知，将其整合入聚合物基组织工程装置的研究仍少；Wu et al.将抗坏血酸加入培养液而非聚合物结构，van Lith et al.将柠檬酸和抗坏血酸并入聚酯主链，Shiekh et al.以抗坏血酸为扩链剂开发抗氧化聚氨酯并电纺植入大鼠神经替代研究。将抗坏血酸引入聚氨酯主链的理论优势包括高力学可调性和可加工性。本研究中PCAU-100作为单独聚合物力学不足且电纺加工不稳定，可能与其分子量较低有关，故需与PCUU共混；PCAU-25力学指标与PCUU相似并成功电纺成相似微结构纤维网。PCAU-25较PCUU具ROS抑制、抗钙化和降低细菌定植的体外优势。体内植入PCAU-25、PCUU、GLUT和DECELL，GLUT作为正对照、DECELL作为负对照；PCAU-25降解更快，可能解释4周皮下植入后支架内高细胞浸润，其表现更接近DECELL而非PCUU；尽管细胞浸润明显，PCAU-25支架内无明显钙化，GLUT钙覆盖达21%，而两种聚合物与DECELL均低钙化。作者强调简单皮下模型不能直接外推至血液接触和力学动态的原位瓣膜测试，4周不足以显示聚合物完全吸收，PCUU未见降解证据，故PCAU是否较PCUU具额外长期抗钙化保护仍不清楚；文献提示TEHV肺动脉瓣临床前钙化风险随时间增加，可能与慢性炎症相关。PCAU-25体外ROS清除优于PCUU，但体内免疫细胞存在和炎症反应显著更高；免疫反应多因素，降解速率差异可能使直接比较复杂，较快降解可能通过微环境改变或持续吞噬支架降解产物维持M1样巨噬细胞表型，未来可分析氧自由基和氧化损伤特异标志物。PCAU-25与DECELL在细胞浸润和细胞反应上的相似性令人鼓舞。PCAU-25抗S. aureus黏附可能有助于降低人工瓣膜心内膜炎（PVE）风险，但本研究仅比较聚合物间细菌黏附，抗菌潜力尚需与临床BHV组织比较。PCAU-25共混物具足够力学完整性以电纺成聚合物心脏瓣膜几何结构，瓣膜较既往报道更顺应且各向同性，但功能表现与既往瓣膜接近；未来可在肺动脉位置植入PCAU-25和PCUU瓣膜并评价钙化与巨噬细胞表型。局限包括PCAU-100力学不稳定、共混降低抗氧化潜力、PCUU与PCAU-25体内降解差异妨碍直接比较、4周不足见PCUU细胞浸润或降解、GLUT为自制且不代表当前临床BHV抗钙化处理方法。

研究结论翻译：研究人员描述了一种清除ROS的聚氨酯的合成与表征，目标是拓展用于TEHV开发的可行设计聚合物策略。PCAU的力学稳定性通过与PCUU共混得到补充。PCUU和PCAU-25支架以相似微结构制备，体外测试显示PCAU-25较PCUU具有更强ROS抑制和降解，并减少钙化和细菌黏附。在幼年大鼠皮下植入4周后，PCAU-25、PCUU、DECELL和GLUT牛心包的两种聚合物样本钙化均可忽略。与PCUU相比，PCAU-25观察到更多细胞浸润，提示降解速率更快；PCAU-25还观察到更强炎症免疫反应，可能由于降解速率差异。最后，研究证明了制备PCAU-25瓣膜并通过基本力学测试和水动力评估进行表征的可行性。尽管仍需进一步设计修改和测试，这些概念验证结果提示PCAU作为心脏瓣膜替代物抗氧化材料的潜力。