《Medical and Veterinary Entomology》：Metagenomic detection and characterization of RNA viruses associated with Rhipicephalus linnaei (Audouin, 1826) ticks from the Amazon, Pará, Brazil
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近年来，蜱传病毒（tick-borne viruses, TBVs）因与脊椎动物相关的致死病例报告，以及通过分子技术尤其高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）在硬蜱中鉴定出广泛多样性的病毒，在公共卫生和兽医卫生中受到显著关
近年来，蜱传病毒（tick-borne viruses, TBVs）因与脊椎动物相关的致死病例报告，以及通过分子技术尤其高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）在硬蜱中鉴定出广泛多样性的病毒，在公共卫生和兽医卫生中受到显著关注。本研究旨在采用宏基因组（metagenomics）方法调查巴西亚马孙州帕拉州两个不同地区Rhipicephalus linnaei蜱中的RNA病毒。研究人员基于线粒体基因组的COXI基因确认Rhipicephalus linnaei标本。研究人员报告巴西首次记录Brown dog tick mivirus 1（Mivirus rhipicephali；Chuviridae科）和Brown dog tick phlebovirus 2（Uukuvirus tobagoense；Phenuiviridae科），以及Uukuvirus tobagoense、Castanhal tick orthomyxovirus（Orthomyxoviridae科）、Guangdong tick quaranjavirus（Orthomyxoviridae科）、Alpharicinrhavirus taishun（Rhabdoviridae科）和Zhangye Rhabd tick virus 1（Rhabdoviridae科）的部分片段。该研究鉴定了与公共卫生和动物健康具有潜在相关性的病毒，并扩展了关于蜱种群中病毒地理分布的知识，尤其是具有媒介重要性的物种。在此背景下，针对硬蜱种群的研究对于阐明病毒生态学、识别潜在新发病原体以及评估对公共卫生和动物健康的风险至关重要，有助于改进疾病监测和预防策略。
研究背景：人畜共患病可由脊椎动物传至人，也可由人传至其他脊椎动物，既影响人类健康，也影响畜牧业、生态系统和野生动物多样性。人类因人口扩张或旅游不断进入自然栖息地，增加暴露于新生态和新发人畜共患感染的机会。气候变化影响媒介行为与动态，改变潜在新发和再发人畜共患病的分布，并可能通过突变和重组影响病原演化。近年来，蜱传病毒（tick-borne viruses, TBVs）在公共卫生和兽医卫生中受到重视，原因包括脊椎动物相关致死病例报告以及高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）在硬蜱中发现的广泛病毒多样性。蜱为专性吸血节肢动物，是重要感染性病原媒介，尤其传播TBVs；其传播给脊椎动物的多数病毒感染为RNA病毒，涉及Flaviviridae、Nairoviridae和Phenuiviridae等科。Rhipicephalus linnaei (Audouin, 1826)属于Rhipicephalus sanguineus复合群，分布于美洲、非洲、大洋洲、亚洲和欧洲，并与Rhipicephalus sanguineus sensu stricto共存于巴西、阿根廷、智利、墨西哥和美国等地；该种近期被重新有效并指定为R. sanguineus sensu lato复合群中的“热带谱系”，不同于R. sanguineus s. s.，这对既往未正确鉴定的研究有影响。针对R. sanguineus s. l.复合群的宏基因组研究已揭示多种与公共卫生和兽医卫生相关的病毒科及大量未分类病毒；鉴于Flaviviridae中许多虫媒病毒（arthropod-borne viruses, arboviruses）可致人和脊椎动物疾病，持续探索蜱病毒十分必要。发展中国家蜱病毒组研究有限，南美洲蜱传疾病可能被低估；巴西尤其巴西亚马孙关于Rhipicephalus属蜱病毒多样性的研究仍有限。R. sanguineus s. l.在巴西家畜寄生常见，尤其在巴西亚马孙；但R. linnaei病毒组组成知之甚少。亚马孙雨林是全球虫媒病毒重要储库，气候地理条件利于蚊、沙蝇和蜱等吸血节肢动物增殖，是虫媒病毒监测的重要环境；当地研究多集中于蚊媒虫媒病毒，R. linnaei等蜱的病毒多样性尤其新病毒或潜在致病变异尚未充分阐明。因此，研究人员采用病毒RNA宏基因组学方法，调查巴西亚马孙帕拉州两个不同地区R. linnaei蜱中的RNA病毒，以鉴定具有公共卫生和动物健康潜在相关性的病毒，并扩展蜱种群病毒地理分布知识，为病毒生态学、潜在新发病原识别及疾病监测和预防策略提供依据。
研究人员开展的研究、结论和意义：研究人员从巴西帕拉州Castanhal和Belém采集R. linnaei标本，经形态学和线粒体COXI基因及13个蛋白编码区确认后，对2只成年雄性半饱血蜱（AR899866、AR905516）进行RNA病毒宏基因组检测。研究获得约46 million reads，其中约39 million用于基因组组装，约3 million用于后续分析；组装和BLASTx分析获得10条目标contigs，归入Chuviridae、Phenuiviridae、Rhabdoviridae、Orthomyxoviridae和Totiviridae等病毒科。研究人员报告巴西首次记录Brown dog tick mivirus 1（Mivirus rhipicephali；Chuviridae科）和Brown dog tick phlebovirus 2（Uukuvirus tobagoense；Phenuiviridae科），并检测到Uukuvirus tobagoense、Castanhal tick orthomyxovirus、Guangdong tick quaranjavirus、Alpharicinrhavirus taishun和Zhangye Rhabd tick virus 1的部分片段。结论是这些病毒属于包含已知感染脊椎动物成员、部分与医学和兽医重要疾病相关的分类群，但其感染潜力、宿主范围和致病性仍未知且未研究；发现不应解释为检测病毒是脊椎动物病原体的证据，而应视为属于公共卫生和动物健康相关病毒分类群。研究意义在于扩展蜱相关病毒地理分布和多样性知识，尤其巴西亚马孙欠探索地区，并提供可用于后续病毒多样性、宿主范围、致病潜力和监测预防研究的数据资源。
关键技术方法（不超过250字）：样本来自巴西帕拉州Castanhal和Belém居民犬舍附近城市与森林环境，为经形态学及线粒体COXI基因和13个蛋白编码区确认的R. linnaei成年雄性半饱血蜱各1只（AR899866、AR905516；Sisbio/ICMBio No. 100524-1）。研究人员提取总RNA，合成双链cDNA并构建Nextera XT基因组文库，在NextSeq 500平台进行150 bp双端测序；经Fastp质控、SortMeRNA去除rRNA、MEGAHIT从头组装，DIAMOND/BLASTX筛选，MEGAN以最低共同祖先（lowest common ancestor, LCA）算法分类，Bowtie2映射估算病毒丰度；用Geneious、Clustal Omega比对，IQ-TREE构建最大似然树并以1000次超快自举（ultrafast bootstrap, UFB）评估支持，InterPro注释功能域。
研究结果：
数据处理（Data processing）：基于COXI分子标记和13个蛋白编码区确认两地区R. linnaei标本；高通量测序共获得约46 million reads，约39 million用于基因组组装，约3 million用于后续分析；组装和BLASTx获得目标contigs并列明各检测病毒的覆盖度和深度信息。
病毒丰度（Viral abundance）：对两个样本的病毒操作分类单元（viral operational taxonomic units, vOTUs）与nr和RefSeq数据库双重比对并映射至过滤后reads，归入五个病毒科；Chuviridae最丰富，映射reads为4834，其次为Phenuiviridae（2004）、Rhabdoviridae（17）、Orthomyxoviridae（16）和Totiviridae（15）。
Chuviridae：该科仅在样本AR899866检出；组装和分类获得含三个基因组区域的完整病毒序列，含S、M、L三个开放阅读框（open reading frame, ORF），L长6471 nt、M长2055 nt、S长1443 nt，L基因含RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）相关保守功能域。按ICTV种划分标准，L基因核苷酸和氨基酸与Brown dog tick mivirus 1（Mivirus rhipicephali，MN025520）一致性分别为99.1%和99.6%；系统发育显示该序列与Mivirus rhipicephali形成高支持亚支（UFB=99%），并提示MN095545和OP628551可能被误分类为Mivirus changpingense。
Orthomyxoviridae：该科在两个样本中均检出，但仅AR899866组装出代表contigs，长度463和1636 nt；前者为PB1基因部分区域，与Orthomyxoviridae sp.（ON872641）核苷酸一致性100%，后者为核蛋白基因，与Guangdong tick quaranjavirus（GTQV，OM273646）核苷酸一致性87.46%；PB1部分片段含负义分节RNA病毒RdRp催化域。使用ICTV提供的PB1和核蛋白基因序列及NCBI代表序列比对，PB1（部分）和核蛋白基因核苷酸与ON872641和OM273646一致性分别为100%和53.9%，氨基酸一致性分别为38%和69.7%；系统发育显示所得序列位于Quaranjavirus属分支（UFB=100%），命名为Castanhal tick orthomyxovirus的序列与已知Quaranjavirus高度分歧。
Phenuiviridae：该科在两个R. linnaei标本中均检出，共获5条contigs，AR899866有2条、AR905516有3条；BLASTx显示与Phenuiviridae内未分类病毒高度一致，其中4条序列含RdRp相关保守功能域。L段氨基酸和核苷酸比对显示，4条含RdRp相关域序列与Brown dog tick phlebovirus 2（Uukuvirus tobagoense）相关；系统发育中片段和完整基因段均位于Uukuvirus属、Uukuvirus tobagoense亚支，Lihan tick virus（Uukuvirus lihanense）为姐妹亚支，所有系统发育推断UFB=100%。该病毒为双节段病毒（L和S），缺M节段，L和S分别编码RdRp和核蛋白；此前主要在特立尼达和多巴哥的R. sanguineus和R. microplus中描述，后在中国、罗马尼亚和泰国报告，尚无病毒分离证据；本研究为巴西首次记录Brown dog tick phlebovirus 2。
Rhabdoviridae：该科仅在样本AR905516检出，组装获2条contigs，BLASTx分别与Taishun tick virus（Alpharicinrhavirus taishun，MH688521）和Zhangye Rhabd tick virus 1（PQ754346）相关；虽片段短，但含Rhabdoviridae科病毒特征性功能域，与Mononegavirales的RdRp相关。以L基因进行系统发育推断，所得氨基酸序列与Zhangye Rhabd tick virus 1和Alpharicinrhavirus taishun一致性分别为68.3%和60%；两条序列均位于Alpharicinrhavirus属分支，并与BLASTx鉴定序列及ICTV参考序列形成高支持亚支（UFB>97%）。
讨论部分总结：讨论指出，两样本间reads数差异约23 million在蜱病毒组研究中常见，可能与生物样本内在特征、文库制备效率、遗传物质质量和样本生物学复杂性等技术因素有关。本研究10条目标contigs中8条对应RdRp，RdRp高度保守，在比对和BLASTx中显示最高氨基酸一致性，是系统发育和分类的重要标记；RNA病毒因基因组复制缺乏校正机制而突变率高，可产生遗传变异，并可能有利于病毒适应和宿主范围改变，提出未来溢出事件的可能性。Chuviridae为负义RNA病毒科，含16属；Mivirus属经ICTV近期认可，含10种已分类病毒，其中9种在蜱中发现，另有24种未分类相关病毒；Mivirus rhipicephali此前在特立尼达和多巴哥R. sanguineus中发现，与本研究序列氨基酸一致性99.6%；Mivirus属已在蜱病毒组尤其Rhipicephalus属中检测，但致病潜力尚无明确证据；蜱寄生多种脊椎动物并偶叮人，可能形成促进病毒—宿主互作的生态界面。Orthomyxoviridae为分节段负义单链RNA病毒科，含9属，Thogotovirus和Quaranjavirus主要经蜱传播并偶感染脊椎动物；本研究序列与PB1和核蛋白基因相关，尤其位于Quaranjavirus属；该属现含6种，多数在蜱和鸟中鉴定，提示蜱作为媒介的强关联；GTQV含6个基因组节段（PB2、PB1、PA、NP、HA和M），长930—2422 bp；本研究片段与Rhipicephalus蜱中既往鉴定的quaranjavirus有核苷酸和氨基酸一致性；Castanhal tick orthomyxovirus与已知Quaranjavirus高度分歧，相关研究多来自NGS；GTQV与Quaranjavirus wellfleetense（WFBV）系统发育相近，WFBV与美国东北部鸟类周期性死亡事件相关，实验感染鸟可出现病理损伤并可回收病毒，但quaranjavirus分子致病机制仍 largely unknown。Phenuiviridae含23属159种180种病毒，基因组为分节段负义或双义RNA；Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome Virus（Bandavirus dabieense）和Heartland virus（Bandavirus heartlandense）是重要蜱传虫媒病毒，可致人轻至重度感染；本研究鉴定5个Brown dog tick phlebovirus 2（Uukuvirus tobagoense）病毒节段，该病毒首次在特立尼达和多巴哥R. sanguineus和R. microplus中描述，后在中国、罗马尼亚和泰国报告，为双节段病毒（L和S），缺M节段，L和S分别编码RdRp和核蛋白，目前仅通过NGS研究鉴定，尚无病毒分离证据；Uukuvirus一般被认为非致病，但2018年分离的Kabuto mountain virus（Uukuvirus kabutoense）强毒株可在小鼠引起感染和高死亡率，其他种包括对人的感染潜力知之甚少，因此需进一步研究巴西其他地区蜱微生物组，尤其RNA病毒。Rhabdoviridae含4亚科62属580种，基因组为单链或分节段负义RNA，可感染植物、脊椎动物和节肢动物；Alpharhabdovirinae含34属，感染脊椎动物、无脊椎动物或两者及其节肢媒介；本研究报道与Taishun tick virus（Alpharicinrhavirus taishun）和Zhangye Rhabd tick virus 1（ZyRTV1）相关的两个部分片段，后者仍未分类但与Rhabdoviridae相关；Alpharicinrhavirus已在澳大利亚、克罗地亚、中国、泰国、挪威等多地多种蜱中通过高通量测序鉴定，但尚无代表种成功分离；ZyRTV1首次记录于中国，分布似限于中国；与可感染哺乳动物细胞并在实验小鼠致死、在Hyalomma anatolicum中鉴定的Zahedan rhabdovirus（Zarhavirus zahedan）不同，目前无具体证据表明ZyRTV1对动物或人致病。一个样本获得完整病毒基因组，提示存在活动或近期感染，并支持更稳健的分类和生物学潜力推断；另一样本仅揭示含保守区的病毒片段，可能反映低病毒载量、遗传物质降解或测序和组装过程固有限制，因其原始数据少三倍；片段虽有助于初步检测，但可能限制完整系统发育重建等深入分析。
研究结论部分翻译：本研究采用宏基因组方法调查巴西亚马孙帕拉州不同地理区域R. linnaei蜱中的RNA病毒。研究鉴定出属于包含已知感染脊椎动物成员、部分与医学和兽医重要疾病相关成员的病毒科。然而，所鉴定病毒的感染潜力、宿主范围和致病性仍未知且未研究。因此，这些发现不应解释为检测病毒是脊椎动物病原体的证据，而应解释为它们属于包含公认公共卫生和动物健康相关病毒的分类群。此外，研究人员报告Chuviridae、Phenuiviridae和Rhabdoviridae科病毒种在巴西首次发生，这些病毒种此前未在该国描述。本研究生成的数据集是科学界的宝贵资源，有助于更深入分析蜱相关RNA病毒的多样性和特征。这些发现扩展了当前关于蜱相关病毒地理分布和多样性的知识，尤其是在巴西亚马孙等仍欠探索地区。在此背景下，蜱病毒组研究对于提高对病毒生态学的理解、支持潜在新发病毒鉴定以及为未来评估其宿主范围、致病潜力和可能公共卫生与动物健康影响的研究提供基础至关重要，从而有助于疾病监测和预防策略。
