Ajugol通过调控胆汁酸与花生四烯酸代谢改善小鼠肝纤维化的机制研究

《Phytotherapy Research》：Ajugol Improves Liver Fibrosis by Modulating Bile Acid and Arachidonic Acid Metabolism in Mice

　　

摘要：Ajugol（AJ）是从地黄（Rehmannia glutinosa）根部提取的主要成分，对代谢紊乱和慢性炎症具有保护作用。本研究旨在探讨AJ对肝纤维化的治疗作用及其潜在机制。通过给予15% CCl4诱导C57BL/6J小鼠肝纤维化，随后以20和40 mg/kg剂量灌胃给予AJ。研究人员进行了组织病理学评估、血清生化检测、RNA测序和靶向代谢组学等综合评价。体外模型包括DCA刺激的AML12和RAW264.7细胞。与未治疗的纤维化小鼠相比，AJ干预降低了血清ALT和AST水平，以及肝组织羟脯氨酸、α-SMA和COL1A1含量。转录组学分析显示，AJ显著调控参与初级胆汁酸（BA）生物合成和花生四烯酸（ARA）代谢的关键基因。AJ下调CYP7A1表达，减少小鼠肝脏中有毒脱氧胆酸（DCA）的蓄积。此外，AJ降低COX-2、PTGR1、PTGR2和HPGDS的表达，以及下游代谢产物前列腺素PGD2和PGE2的水平，从而通过COX通路改善ARA代谢。AJ的抗炎作用体现为促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及巨噬细胞标志物F4/80和CD11b水平的降低。体外实验中，AJ减轻了DCA诱导的肝细胞损伤并抑制巨噬细胞促炎细胞因子的产生。DCA抑制核FXR激活，损害肝细胞功能并激活炎症反应，而AJ有效恢复了这些功能。AJ部分通过减轻有毒BA蓄积的有害影响来改善肝脏炎症和纤维化，这凸显了AJ作为肝纤维化新型治疗药物的潜力。

论文解读：Ajugol通过调节胆汁酸与花生四烯酸代谢改善小鼠肝纤维化

一、研究背景与意义

肝纤维化是由病毒感染、酒精摄入、胆汁淤积和自身免疫性疾病等多种慢性肝损伤因素导致的全球性健康挑战。该病理过程具有高度动态性，可通过消除病因或使用治疗药物得以延缓甚至逆转。肝纤维化进展的关键驱动因素包括肝细胞死亡、免疫细胞浸润和肝星状细胞（HSC）活化。肝脏炎症作为纤维化的标志性特征，源于各类肝细胞对肝细胞损伤和炎症介质的响应，并受到肝内损伤通路及肝外因素（包括微生物代谢物和胆汁酸（BA））的显著影响。持续炎症导致细胞外基质（ECM）蓄积，最终形成肝纤维化。因此，通过抑制炎症促进纤维化消退和肝脏修复具有重要意义。

胆汁酸在肝脏病理生理中参与调节自身稳态、炎症和免疫。在纤维化肝脏中，肠肝循环失调导致有毒胆汁酸蓄积，包括胆酸（CA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA），从而加重肝损伤。过量胆汁酸抑制法尼醇X受体（FXR）信号，进而激活胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）转录，加剧胆汁酸合成，形成恶性循环。此外，胆汁酸可通过失活FXR触发NF-κB通路，诱导促炎细胞因子和酶（包括TNF、iNOS、COX-1/2等）的产生。COX-1/2上调可刺激花生四烯酸（ARA）代谢生成促纤维化前列腺素（PGs）。因此，调节胆汁酸和ARA代谢可能实现多通路干预，为抗肝纤维化提供新策略。

天然产物（生物碱、黄酮类、萜类和甾体皂苷）在改善肝纤维化方面的治疗潜力日益受到认可。地黄（Rehmannia glutinosa）作为玄参科传统中药，用于滋阴补肾，已被证实对肝脏疾病等慢性疾病具有潜在益处。Ajugol（AJ）作为地黄根中的环烯醚萜苷，已在气道炎症、肾损伤、骨关节炎和非酒精性脂肪性肝病中显示出抗炎作用，提示其对代谢应激具有潜在保护机制。本研究旨在探讨AJ对肝纤维化的治疗作用及其分子机制。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用C57BL/6J雄性小鼠（体重22±2 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司），通过腹腔注射15% CCl₄/橄榄油溶液（2 mL/kg，每周三次，持续6周）诱导肝纤维化模型。从第4周起，CCl₄处理小鼠随机分为四组，分别每日灌胃给予AJ（20、40 mg/kg）和索拉非尼（10 mg/kg）。主要技术方法包括：UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS鉴定地黄水提物化学成分；UHPLC-MS/MS定量检测生物样本中胆汁酸和花生四烯酸代谢物；RNA测序分析肝组织转录组变化（由上海欧易生物医学科技有限公司完成数据分析）；组织病理学评估（H&E和天狼星红染色）；免疫组织化学和免疫荧光染色；Western blotting和qRT-PCR检测蛋白和基因表达；体外实验采用DCA刺激AML12和RAW264.7细胞模型。

三、主要研究结果

3.1 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS鉴定地黄水提物化学成分

通过质谱分析，在负离子模式下检测到16个色谱峰，正离子模式下检测到2个峰，共鉴定出18种化合物，分为环烯醚萜苷和酚酸两类。其中梓醇（catalpol）、AJ和地黄苦苷元（rehmapicrogenin）在水提物、小鼠血清和肝组织中含量较高。酚酸类中阿魏酸（ferulic acid）和异阿魏酸（isoferulic acid）含量较高。在AML12细胞中，AJ、桃叶珊瑚苷（aucubin）和地黄苷B1（jionoside B1）显著增加白蛋白（ALB）水平，其中AJ在100 μM浓度下使ALB水平提高2.9倍，呈浓度依赖性。

3.2 AJ改善CCl₄诱导肝纤维化小鼠的肝功能

与正常组相比，CCl₄组血清ALT和AST分别升高4.38倍和2.28倍，肝组织羟脯氨酸（HYP）含量增加约6.21倍。AJ干预显著降低这些指标，使其恢复至接近基线水平。H&E染色显示AJ治疗组肝组织结构改善，坏死区域减少；天狼星红染色显示AJ有效抑制胶原纤维蓄积。ALB免疫组化染色显示AJ干预增加了ALB阳性染色强度和阳性肝细胞数量。

3.3 AJ降低CCl₄诱导纤维化肝脏中COL1A1和α-SMA表达

免疫荧光和免疫组化染色显示，CCl₄组红色荧光信号显著增强，表明胶原沉积增加，而AJ和索拉非尼干预减弱了该信号。Western blotting证实高剂量AJ降低纤维化肝脏中α-SMA蛋白表达，qRT-PCR显示α-SMA mRNA水平下降3.8倍，表明AJ可有效减少纤维化瘢痕并促进肝纤维化逆转。

3.4 AJ影响CCl₄诱导纤维化小鼠的肝脏转录组谱

RNA测序分析显示，与正常组相比，CCl₄组有391个基因下调和1700个基因上调；AJ治疗后312个基因下调和118个基因上调。Venn图分析确定264个共享基因，其中49个上调和215个下调。KEGG通路富集分析显示这些差异表达基因显著富集于花生四烯酸代谢和初级胆汁酸生物合成通路。在ARA代谢中涉及11个关键基因，AJ上调CYP450家族基因表达，但下调Ptgs2、Ptgr1、Ptgr2和Hpgds的表达，提示AJ可能通过调控COX通路恢复ARA代谢并抑制炎症反应。

3.5 AJ降低CCl₄诱导纤维化肝脏中CYP7A1表达和DCA水平

靶向代谢组学检测了18种胆汁酸浓度。CCl₄组中5种结合型初级胆汁酸、3种非结合型次级胆汁酸和3种结合型次级胆汁酸显著增加。其中DCA（有毒胆汁酸）增加4.1倍。CYP7A1蛋白和基因水平分别上调2.2倍和4.2倍。CCl₄组核FXR蛋白水平显著降低，SHP表达下降，削弱了对CYP7A1的抑制作用，导致胆汁酸过度产生。AJ干预恢复了FXR/SHP信号，抑制CYP7A1介导的胆汁酸过度合成，降低纤维化肝脏中有毒胆汁酸浓度。

3.6 AJ降低CCl₄诱导纤维化肝脏中COX-2表达和前列腺素水平

CCl₄损伤对HETEs和EETs水平影响较小，但显著改变ARA、PGD2和PGE2水平。CCl₄组ARA水平下降3.5倍，PGD2和PGE2分别增加1.5倍和2.1倍。IL-6、IL-1β、TNFα及巨噬细胞标志物F4/80和CD11b的基因和蛋白表达显著上调。转录组数据显示COX通路中Ptgs2、Ptgr1、Ptgr2和Hpgds四个基因可被AJ显著下调，其转录水平变化与蛋白表达变化一致。这些结果表明AJ通过COX通路调节ARA代谢，减少PGD2和PGE2过度产生及促炎细胞因子表达，抑制巨噬细胞活化，从而减轻炎症反应和肝纤维化。

3.7 AJ减轻DCA诱导的肝细胞损伤和炎症

体外实验显示，DCA对AML12和RAW264.7细胞呈浓度依赖性细胞毒性，IC₅₀分别为106.8 μM和94.73 μM。在低于25 μM浓度下虽无细胞活力下降，但AML12细胞出现功能性损伤，表现为ALB mRNA和蛋白水平降低。DCA通过下调FXR和上调CYP7A1破坏胆汁酸稳态。AJ干预恢复了ALB表达和FXR/CYP7A1平衡。在RAW264.7细胞中，DCA诱导促炎激活，表现为PGE2、COX-2、IL-6、CCL2和CD11b水平升高，AJ干预有效降低这些指标。

四、讨论与结论

既往研究表明环烯醚萜苷可能作为神经系统疾病、糖尿病、心血管疾病、关节炎和癌症的潜在治疗药物。本研究证实地黄水提物中环烯醚萜苷（梓醇和AJ）可增强AML12细胞ALB产生，而酚酸类呈轻度抑制作用。AJ通过双重调节机制改善肝脏炎症和纤维化：恢复FXR/SHP/CYP7A1信号以减少胆汁酸蓄积，以及改善COX-2介导的ARA代谢。DCA在纤维化肝脏中增加约4.1倍，呈剂量依赖性细胞毒性，而非结合型胆汁酸的毒性顺序为CA、CDCA、DCA、LCA递增。FXR激活SHP后介导对CYP7A1的抑制，而纤维化肝脏中FXR激活受阻导致SHP下调和CYP7A1上调。AJ干预增加细胞核中FXR水平，恢复FXR/SHP/CYP7A1信号。在ARA代谢的COX、LOX和CYP450三条通路中，AJ主要影响COX通路，显著降低COX-2、PTGR1、PTGR2和HPGDS的表达及下游产物PGD2和PGE2水平。受损肝细胞可启动炎症反应，激活巨噬细胞并促进促炎反应，而肝脏炎症在很大程度上受胆汁酸、脂多糖（LPS）、游离脂肪酸（FFA）和瘦素等肝外介质调节。体外实验证实DCA抑制FXR信号、上调CYP7A1并激活COX通路，AJ干预可逆转这些病理过程。

五、研究结论

本研究证明AJ作为地黄来源的环烯醚萜苷，可通过调节胆汁酸和花生四烯酸代谢并抑制炎症反应，改善CCl₄诱导的小鼠肝纤维化。AJ治疗显著降低血清AST和ALT水平，减少胶原蓄积和炎症浸润，延缓肝纤维化进展。转录组学分析揭示AJ影响特定代谢通路，尤其是胆汁酸合成和ARA代谢相关通路。机制上，AJ通过降低CYP7A1表达减轻细胞毒性DCA蓄积，并通过COX通路抑制ARA相关炎症。这些发现表明AJ有望成为肝纤维化的新型治疗药物。