基于TurboID邻近标记的TGN上ARF1与ARF3邻近蛋白质组学分析

《PROTEOMICS》：Proteomic Analysis of ARF1- and ARF3-Proximal Proteins at the Trans-Golgi Network

摘要专业翻译 尽管具有根本性的重要性，高尔基体后运输的分子机制仍未被完全理解。高尔基体后运输载体的形成依赖于ARF3和ARF1——两个非常接近的旁系同源物；前者定位于反式高尔基网络（trans-Golgi network，TGN），而后者定位于TGN和顺式高尔基体。鉴定TGN上的ARF1/3相互作用因子对于阐明高尔基体后运输机制至关重要。为此，研究人员使用了GBF1M832L细胞，在该细胞中，通过加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A，BFA）抑制反式高尔基体定位的ARF核苷酸交换因子BIG1/2，可使TGN上的ARFs分散，而不干扰顺式定位的ARFs或高尔基体结构。研究人员在经BFA处理和未经BFA处理的GBF1M832L细胞中，利用膜通透性生物素甲酯（biotin methyl ester，BME）增强的TurboID技术，对TGN上的ARF1和ARF3邻近蛋白进行了蛋白质组学分析。通过比较这些条件，鉴定出TGN定位的ARF1或ARF3所特有的邻近蛋白，以及两者共有的邻近蛋白。ARF1特异的邻近蛋白SMAP1和ARF1/3共有的邻近蛋白LRBA以BIG1/2依赖的方式定位于高尔基体，而ARF3特异的邻近蛋白Rab3IL1则以BIG1/2非依赖的方式定位于循环内体。本研究建立了一种选择性调控高尔基体后运输并绘制TGN上ARF依赖性相互作用网络的方法，为理解载体形成的分子机制提供了框架。

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一、研究背景与科学问题

细胞内约30%的蛋白质在内质网合成后定向运输至高尔基体。这些被称为“货物”的蛋白质从高尔基体顺式面进入，通过池成熟过程沿顺行方向推进至反式面，最终到达反式高尔基网络（trans-Golgi network，TGN）——高尔基体最反式侧的膜系统。TGN作为主要的货物分选站，将货物包装进特定的高尔基体后运输载体并运送至目的地或分泌至胞外。然而，许多货物的高尔基体后运输载体身份仍不清楚。

ARF GTPases是载体形成的关键调控因子。人类高尔基体中含有四种ARF：ARF1、ARF3、ARF4和ARF5。ARF4和ARF5定位于高尔基体顺式侧，ARF3定位于反式侧及循环内体（recycling endosome，RE）或Rab4阳性内体膜上，ARF1则广泛分布于从顺式到反式高尔基体及循环内体。与其他小GTPase类似，鸟嘌呤核苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）激活ARF使其处于GTP结合形式，而GTPase激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）使其失活为GDP结合形式。高尔基体含有三种ARFGEF：GBF1和BIG1/2，其中GBF1定位于顺式侧，BIG1/2定位于反式侧。布雷菲德菌素A（Brefeldin A，BFA）可抑制这些ARFGEF。

此前研究已建立GBF1^M832L HeLa细胞系，该细胞系中GBF1对BFA具有抗性，因此BFA可特异性破坏BIG1/2的功能。在该细胞系中，BFA处理后ARF3和反式定位的ARF1扩散至细胞质，而ARF4和ARF5仍定位于高尔基体。三种货物——糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白、水泡性口炎病毒G蛋白和肿瘤坏死因子α——的高尔基体后运输被BFA抑制，且洗脱后可迅速恢复。这表明ARF1和ARF3对高尔基体后运输至关重要，GBF1^M832L细胞与BFA的组合可作为鉴定参与高尔基体后载体形成因子的有效工具。

尽管已有广泛的ARF家族蛋白质组学研究，但特异性调控高尔基体后运输的ARF相互作用因子仍未得到充分鉴定。本研究旨在利用BME-TurboID技术在BFA处理和未处理的GBF1^M832L细胞中进行蛋白质组学分析，鉴定TGN上ARF1和ARF3的特异性相互作用因子。

二、研究内容与主要结论

研究人员构建了ARF1、ARF3和ARL1与TurboID及串联Clover3（Cv）荧光蛋白的融合表达载体，通过中长连接子（ML，29个氨基酸）或长连接子（LL，70个氨基酸）连接。定位分析表明，ARF1::ML::TurboID::Cv和ARF3::LL::TurboID::Cv定位于高尔基体，而ARF1::LL和ARF3::ML则主要分布于细胞质。BFA处理后，ARF1/3-TurboID融合蛋白均定位于细胞质，而ARL1::ML::TurboID::Cv在BFA处理前后均定位于高尔基体。基于定位和生物素化结果，研究人员选择ARF1::ML::TurboID::Cv、ARF3::LL::TurboID::Cv和ARL1::ML::TurboID::Cv进行蛋白质组学分析。

通过比较BFA处理和未处理条件下的邻近蛋白质组，并结合ARL1:BFA+作为对照以排除BFA不敏感的高尔基体驻留蛋白，研究人员鉴定出ARF1^GTP特异性邻近蛋白40个、ARF3^GTP特异性邻近蛋白44个。进一步比较ARF1和ARF3的邻近蛋白质组，鉴定出34个ARF1特异性、14个ARF3特异性和34个ARF1/3共有的相互作用候选因子。AP3复合物亚基、CLINT1和COPI相关组分是ARF1和ARF3共有的相互作用候选因子。ARF1特异性候选因子包括SMAP1、蛋白激酶N1/2（PKN1/2）和TBC1D22B；ARF3特异性候选因子为Rab3IL1；共有候选因子包括TBC1D22A、LRBA、ARF4、Rab11FIP1和SCAMP等。

三、主要关键技术方法

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用GBF1^M832L细胞系结合BFA处理实现TGN上ARF1/3的特异性分散；采用TurboID邻近依赖性生物素化技术，结合膜通透性生物素甲酯（BME）实现快速生物素标记；通过链霉亲和素磁珠富集生物素化蛋白后进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析；使用Mascot和Scaffold软件进行蛋白质鉴定与基于iBAQ的定量分析；利用基因本体（GO）富集分析和STRING蛋白-蛋白关联网络分析进行功能注释；采用AlphaPulldown2进行蛋白-蛋白相互作用结构预测。样本来源于GBF1^M832L HeLa细胞系。

四、研究结果

4.1 鉴定高尔基体反式侧ARF1和ARF3邻近蛋白

研究人员利用BFA处理和未处理的GBF1^M832L细胞进行差异蛋白质组学分析。ARF1:BFA-与ARF1:BFA+比较显示25个蛋白显著上调、9个下调。AP3亚基和CLINT1在BFA-条件下富集，与BFA处理使AP1和AP3分散的报道一致。COPI包被组分（COPA、COPB1、ARCN1）及ARFGAP2/3或SCYL1在ARF1:BFA-中显著增加。但COPI定位分析不支持COPI在反式高尔基体/TGN发挥功能的简单模型，更可能反映BIG1/2招募的ARF1参与COPI包被向ER的逆行运输。

4.2 ARF1邻近蛋白的鉴定

通过将ARF1:BFA-与ARL1:BFA+比较，排除BFA不敏感的高尔基体驻留蛋白后，鉴定出40个ARF1^GTP特异性相互作用候选因子。AlphaPulldown2预测显示12个蛋白（包括已知ARF1相互作用因子ARFGAP3和COPB1）的ipTM评分高于0.6，提示可能存在直接相互作用。GO分析显示这些蛋白富集于高尔基体、COPI囊泡包被和运输囊泡。STRING分析揭示COPI、AP2/3和细胞-细胞连接蛋白三个网络。与先前蛋白质组学研究比较，84%的鉴定蛋白被覆盖，并新鉴定BICD1和F11R两个候选因子。

4.3 ARF3邻近蛋白的鉴定

ARF3:BFA-与ARF3:BFA+比较显示25个蛋白显著上调、9个下调。与ARF1类似，AP3亚基、CLINT1和COPI相关组分在ARF3:BFA-中显著上调。通过ARL1:BFA+过滤后鉴定出44个ARF3^GTP特异性相互作用候选因子。AlphaPulldown2预测显示8个蛋白的ipTM评分高于0.6。GO分析显示富集于COPI囊泡包被、运输囊泡、ERGIC和高尔基体。STRING分析显示与ARF1相似的聚类。80%的鉴定蛋白在先前研究中被覆盖，新鉴定TBC1D22A、RAB3L1和FAM111A三个候选因子。

4.4 ARF1和ARF3特异性及共有相互作用候选因子的鉴定

通过比较ARF1:BFA-和ARF3:BFA-并过滤ARL1:BFA+，鉴定出34个ARF1特异性、14个ARF3特异性和34个共有候选因子。AP3亚基、CLINT1和COPI相关组分为共有候选因子。TBC1D22A和TBC1D22B是靶向Rab33的假定GAP，AlphaPulldown2预测ARF1与TBC1D22A/B存在直接相互作用，提示可能存在ARF1/3-TBC1D22A/B-Rab33 GAP级联。SMAP1作为ARF1特异性候选因子，与ARF1共定位于TGN，BFA处理后定位丧失。Rab3IL1作为ARF3特异性候选因子，定位于循环内体，BFA处理后定位保持。LRBA作为共有候选因子，定位于高尔基体，BFA处理后定位丧失。

五、讨论与结论

本研究的策略提供了一个通用平台，用于鉴定TGN来源运输的关键调控因子，并定义ARF依赖性组装如何驱动膜重塑。研究结论指出，TGN上ARF1/3的相互作用伙伴可能参与高尔基体后载体形成，对其相互作用伙伴及功能的综合分析将有助于阐明高尔基体后运输载体形成的分子机制。本研究利用GBF1^M832L细胞和BFA建立了系统阐明TGN中ARF依赖性相互作用网络的策略。然而，该研究的局限性在于未证明ARF1/3与候选蛋白之间的直接相互作用。本研究所鉴定的候选蛋白代表BIG1/2依赖性反式高尔基体/TGN富集的邻近蛋白，未来需要利用直接相互作用实验来确定哪些蛋白与ARF1/3直接相互作用。