《Journal of Molecular Biology》：piRTarBase2: an updated C. elegans piRNA binding site database with extensive evidence for piRNA targeting events
编辑推荐：
•piRTarBase2 编录了由 CLASH 实验定义的 piRNA-靶标相互作用。•常规和非常规结合位点均被纳入。•表达、22G-RNA 和 CIMS 证据支持 piRNA-靶标评估。•结合亲和力分析支持详细的相互作用评估。引言Piwi 相互作用 RNA（piRNA）是一
- •
piRTarBase2 编录了由 CLASH 实验定义的 piRNA-靶标相互作用。
- •
常规和非常规结合位点均被纳入。
- •
表达、22G-RNA 和 CIMS 证据支持 piRNA-靶标评估。
- •
结合亲和力分析支持详细的相互作用评估。
引言
Piwi 相互作用 RNA（piRNA）是一类小型非编码 RNA（ncRNA），在基因调控中发挥关键作用，尤其在维持基因组稳定性方面至关重要。piRNA 通过与 Piwi 蛋白结合发挥作用，形成 piRNA-Piwi 复合物，作为序列特异性引导分子识别互补的靶标 RNA [1]。在识别结合位点后，这些复合物招募 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRP），随后通过生成次级小干扰 RNA（尤其是 22G siRNA）来放大沉默信号。这些次级 siRNA 通过下游 RNA 干扰途径进一步强化基因沉默，最终导致 mRNA 降解或翻译抑制 [2]。在细胞中，精确的分子靶向是实现不同调控和治疗系统中特定生物学效应的根本要求 [3]。由于 piRNA-靶标相互作用决定了这一调控级联反应的特异性和幅度，准确鉴定 piRNA 靶位点对于理解 piRNA 介导的基因沉默的功能影响至关重要。
为促进 piRNA 靶标的鉴定，我们此前开发了 piRTarBase 数据库 [4]，用于系统性地存储秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的 piRNA 结合位点。该数据库主要依赖于 pirScan [5]，这是一种基于种子区域的常规 piRNA 靶向规则来预测 piRNA-mRNA 相互作用的计算工具。虽然这种基于规则的方法能够实现大规模、一致的潜在结合位点鉴定，但它本质上无法捕捉同样参与 piRNA 介导调控的非常规相互作用 [6]。非常规 piRNA 结合位点是指偏离常规种子区域配对规则（用于常规靶标预测）的 piRNA-靶标相互作用 [7]。这些相互作用本质上难以鉴定，即使它们在体内发生，也可能被排除在外，因为不存在固定规则。越来越多的证据表明，piRNA 靶标识别比先前假设的更加灵活，且非常规相互作用可以参与生理相关的基因调控 [8]。因此，鉴定此类相互作用对于定义 piRNA 通路的完整调控范围以及避免系统性低估 piRNA 靶标谱具有重要意义。另一方面，piRTarBase 仅关注 mRNA 靶标，从而忽略了 piRNA 通路中涉及的更广泛谱系的 ncRNA [8]。鉴于 piRNA 靶向启动了一个复杂的调控级联反应，涉及 RdRP 招募和 22G siRNA 的产生，将分析限制在 mRNA 上的预测常规结合位点会限制对 piRNA 调控网络的全面理解。这些局限性凸显了需要对 piRTarBase 进行更综合的更新。解决这些局限性需要实验信息，这些信息能够在不依赖预定义常规结合规则的情况下识别 piRNA-靶标相互作用，并将靶标鉴定扩展到 mRNA 之外。CLASH（杂交连接与测序）等实验技术通过直接在体内捕获 RNA-RNA 双链体，为 piRNA-靶标相互作用提供了有价值的见解 [9]。在 CLASH 实验中，与 Piwi 蛋白结合的 RNA 分子经过交联，连接成嵌合体杂合体并进行测序，从而以核苷酸级别的分辨率识别内源性 piRNA-RNA 相互作用。重要的是，CLASH 数据揭示了 piRNA 靶向经常偏离常规碱基配对规则，发现了大量非常规相互作用 [8]。然而，尽管 CLASH 在生成直接相互作用证据方面具有优势，但由其鉴定的结合对尚未被系统分析或组织成用户友好的存储库，限制了其在研究 piRNA 介导的基因调控方面的可及性和广泛应用。此外，CLASH 实验引入了高噪声水平，需要谨慎加以缓解。
为满足 piRTarBase 的更新需求和 CLASH 结果的分析需求，我们在本研究中开发了 piRTarBase2，作为更全面的 piRNA-靶标相互作用资源。piRTarBase2 主要基于 CLASH 衍生数据集，采用基于 ChiRA [8] 的高级 CLASH 分析流程处理嵌合体 reads，并整合 RNAup 和 pirScan 评估 mRNA 和 ncRNA 上的常规和非常规结合模式，从而捕捉更广泛的 piRNA 相互作用谱。此外，该数据库纳入了多条证据线以进行置信度评估，包括 prg-1 突变条件下基因表达倍数变化、22G RNA 信号 [9] 和交联诱导突变位点（CIMS）分析 [10]，这些证据支持 piRNA 靶向事件的存在及其功能相关性。与前代数据库和原始 CLASH 数据不同，piRTarBase2 将范围扩展到 mRNA 之外，纳入 ncRNA，反映了 piRNA 靶标的多样性。在功能上，piRTarBase2 使用户能够搜索 mRNA 和 ncRNA 中的常规和非常规 piRNA 靶标，为研究 piRNA 介导的调控提供了多功能的、基于证据的平台。piRTarBase2 可免费在线访问，网址为 https://cosbi7.ee.ncku.edu.tw/pirtarbase_v2/。
章节片段
piRTarBase2 概述
我们更新了 piRTarBase2，以提供秀丽隐杆线虫中 piRNA-靶标对的额外分析结果（见图 1）。在 piRTarBase2 中，我们更新了 piRNA-靶标对的数据分析流程，并添加了 22G RNA 丰度和交联诱导突变位点（CIMS）以估计所提取配对的置信度。首先，我们处理了 CLASH 实验的测序结果，并应用 ChiRA 从 CLASH 嵌合体 reads 中识别 piRNA 和靶标 RNA 的身份。为了提供
数据库界面
piRTarBase2 是一个收集秀丽隐杆线虫中全面 CLASH 鉴定的 piRNA-靶标 RNA 对的数据库。在此更新版本中，所存储的 piRNA-RNA 对的精确结合位点由 piRscan 和 RNAup 鉴定。此外，针对鉴定出的配对及其相应提取的结合位点，分析了 prg-1 突变表达倍数变化、22G-RNA sRNA-seq 结果和 CIMS 的相应证据，以帮助评估其置信度。为便于调查
CRediT 作者贡献声明
Yang Tzu-Hsien：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿撰写，可视化，调查。Wang Yi-Ting：可视化，软件。Chen Yu-Cheng：可视化，验证，软件。Wu Wei-Sheng：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿撰写，可视化，监督，数据管理，概念构思。Lee Heng-Chi：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿撰写，数据管理，概念构思。
资金
本工作由国立成功大学、台湾科技部（NSTC 114-2628-E-006-007-MY3, NSTC 112-2221-E-006-129-MY2, NSTC 113-2221-E-006-135-MY3, NSTC 114-2221-E-006-151-MY3）以及美国国立卫生研究院（R35GM164060）支持。本工作还得到国立成功大学医疗器械创新中心的资助，该中心属于高等教育框架内的特色领域研究中心计划
Yang Tzu-Hsien|Wang Yi-Ting|Chen Yu-Cheng|Wu Wei-Sheng|Lee Heng-Chi
