《Journal of Molecular Biology》：Structural basis for HKU5?CoV main protease inhibition by the clinical antivirals nirmatrelvir and ensitrelvir
编辑推荐：
中文摘要翻译：
人畜共患冠状病毒（CoVs）的持续出现给全球公共卫生带来了诸多挑战。在β冠状病毒属中，merbecovirus因其已证实的跨物种传播潜力和高致死率而备受关注。在已确认的蝙蝠来源merbecovirus中， Pipistrellus蝙蝠冠状病毒
中文摘要翻译：
人畜共患冠状病毒（CoVs）的持续出现给全球公共卫生带来了诸多挑战。在β冠状病毒属中，merbecovirus因其已证实的跨物种传播潜力和高致死率而备受关注。在已确认的蝙蝠来源merbecovirus中， Pipistrellus蝙蝠冠状病毒HKU5（HKU5-CoV）与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）亲缘关系密切。近期发现的一个不同谱系HKU5-CoV-2能够高效利用人血管紧张素转换酶2（ACE2）作为功能性进入受体，提示HKU5相关merbecovirus具有显著的跨物种传播风险。主蛋白酶（Mpro），又称3C样蛋白酶，因其在病毒复制周期中的关键作用而成为抗病毒药物研发的重要靶点。尽管nirmatrelvir已被报道在细胞水平抑制ACE2适应性HKU5-CoV-2，但关于HKU5-CoV Mpro抑制机制的结构和生化数据仍然有限。研究人员在此报道了HKU5-CoV-1 Mpro在apo形式及其与nirmatrelvir和ensitrelvir复合物中的首个晶体结构，并结合生物化学和计算分析，定义了跨HKU5-CoV谱系的抑制剂识别分子基础。结构比较显示，HKU5-CoV和SARS-CoV-2的Mpro共享核心折叠，但在S2/S4亚位点存在差异。nirmatrelvir通过硫代亚胺键共价结合催化Cys148，而ensitrelvir以非共价方式占据S1′、S1和S2亚位点。抑制剂结合诱导了S2环的诱导契合构象重排。AlphaFold3建模和分子动力学（MD）模拟证实了HKU5-CoV-2 Mpro中保守的抑制剂结合模式，但也揭示了结构预测在捕捉配体诱导构象变化方面的局限性。这些发现为针对新兴merbecovirus的泛冠状病毒抑制剂设计提供了信息。
论文解读文章：
**研究背景与科学问题**
人畜共患冠状病毒的持续出现对全球公共卫生构成了严峻挑战。严重急性呼吸综合征（SARS）、中东呼吸综合征（MERS）以及新型冠状病毒病（COVID-19）大流行均证明了这一点。系统发育分析表明，这些高致病性病毒最终来源于野生动物储存库，尤其是蝙蝠。在β冠状病毒属中，merbecovirus因其已证实的跨物种传播潜力和高致死率而备受关注。Pipistrellus蝙蝠冠状病毒HKU5（HKU5-CoV）与MERS-CoV亲缘关系密切。历史上，HKU5-CoV被视为局限于蝙蝠的病毒，对人类威胁极小。然而，近期发现的独立谱系HKU5-CoV-2能够高效利用人血管紧张素转换酶2（ACE2）作为功能性进入受体，加之其对多种哺乳动物ACE2直系同源物的广泛使用，表明HKU5相关merbecovirus具有显著的跨物种传播风险。尽管目前尚无HKU5-CoV-2感染人类的病例记录，但MERS-CoV的高致死率凸显了对HKU5相关merbecovirus开展前瞻性研究的必要性。
主蛋白酶（Mpro），又称3C样蛋白酶，在病毒复制周期中负责切割病毒多聚蛋白（pp1a和pp1ab）为功能性非结构蛋白，是抗病毒药物研发的关键靶点。临床药物nirmatrelvir和ensitrelvir针对SARS-CoV-2 Mpro的疗效已在临床试验中得到验证。虽然nirmatrelvir已被报道在细胞水平抑制ACE2适应性HKU5-CoV-2，但关于HKU5-CoV Mpro抑制机制的结构和生化数据仍然十分有限。因此，研究哪些临床Mpro抑制剂能够有效阻断HKU5-CoV主蛋白酶，并通过比较结构和生化分析阐明其抑制的分子机制，对于评估一线蛋白酶靶向抗病毒药物针对新兴人畜共患merbecovirus的稳健性至关重要。
**研究内容与结论**
研究人员报道了HKU5-CoV-1 Mpro在apo形式及其与nirmatrelvir和ensitrelvir复合物中的首个晶体结构，并结合生物化学和计算分析，系统阐明了抑制剂识别HKU5-CoV谱系的分子基础。研究发现，HKU5-CoV-1/2 Mpro对nirmatrelvir和ensitrelvir均表现出纳摩尔级的抑制敏感性（IC50值在30-80 nM范围），与对SARS-CoV-2 Mpro的抑制效力相当。晶体结构揭示，nirmatrelvir通过共价键方式结合催化Cys148，形成硫代亚胺加合物，而ensitrelvir以非共价方式占据S1′、S1和S2亚位点。两种抑制剂结合均诱导了S2环区域发生诱导契合构象重排。计算建模和分子动力学（MD）模拟证实了HKU5-CoV-2 Mpro中保守的抑制剂结合模式，同时揭示了AlphaFold3结构预测在捕捉配体诱导构象变化方面的局限性。这些发现为针对HKU5相关merbecovirus的泛冠状病毒抑制剂设计提供了结构基础。
**关键技术方法**
研究人员采用多种核心技术开展研究。样本来源方面，编码HKU5-CoV-1（GenBank登录号：YP_001039961.1）、HKU5-CoV-2（Genbase登录号：C_AA085189.1）和SARS-CoV-2（GenBank登录号：WPE12197.1）Mpro的基因经密码子优化后在大肠杆菌中重组表达并纯化。主要技术手段包括：基于荧光共振能量转移（FRET）的酶动力学分析和抑制活性测定（IC50）；X射线晶体学技术，在浦项加速器实验室（PAL）11C光束线收集衍射数据，通过分子置换（MR）解析晶体结构；AlphaFold3结构预测结合GROMACS显式溶剂分子动力学（MD）模拟，用于构建和优化HKU5-CoV-2 Mpro-抑制剂复合物模型。
**研究结果**
*Identification of the Mpro from HKU5-CoV lineages 1 and 2*
通过序列比对和FRET-based酶动力学分析，研究人员发现HKU5-CoV-2 Mpro与HKU5-CoV-1和SARS-CoV-2 Mpro的氨基酸序列一致性分别为93%和50%。11个典型多聚蛋白切割位点的比对显示，P1位置在所有三种病毒中均保守为Gln，符合CoV Mpro的底物特异性。HKU5-CoV-1和HKU5-CoV-2 Mpro表现出几乎相同的动力学特征，催化效率（kcat/Km）约为SARS-CoV-2 Mpro的1.8-1.9倍，主要得益于显著更高的周转数（kcat）。
*Overall structure of the apo-Mpro from HKU5-CoV-1*
研究人员成功解析了HKU5-CoV-1 Mpro apo形式的晶体结构（PDB ID: 9VVC），分辨率为1.75 ?。该结构采用CoV Mpro典型的三个结构域架构：结构域I（残基10-98）和结构域II（残基99-199）采用糜蛋白酶样折叠，N-指（残基1-9）和结构域III（残基200-306）介导二聚化。生物活性同源二聚体通过N-指介导的协作性相互作用网络稳定，埋藏表面积约1,298 ?2/单体。
*Conservation and divergence of active sites between HKU5-CoV and SARS-CoV-2 Mpro*
结构叠加显示HKU5-CoV-1与SARS-CoV-2 Mpro的整体结构高度保守，催化二元体（His41-Cys148）和氧阴离子孔精确重叠。S1亚位点结构高度保守，与P1-Gln不变特异性一致。S2亚位点中，含Leu49的环区域呈现独特构象，相对SARS-CoV-2中的Met49向外位移约4.8 ?，形成更开放的S2空腔。S3-S4区域中，S4环的Ser171（对应SARS-CoV-2 Pro168）位移约5 ?，导致HKU5-CoV-1具有更扩展的S4空腔。
*Cross-species inhibitory potency and structure determination using clinical Mpro inhibitors*
酶学抑制实验显示，nirmatrelvir对HKU5-CoV-1、HKU5-CoV-2和SARS-CoV-2 Mpro的IC50值分别为33.8 ± 4.2、34.8 ± 4.8和39.8 ± 7.2 nM，三种酶之间无显著差异。ensitrelvir的IC50值分别为50.3 ± 2.4、76.2 ± 26.8和37.1 ± 2.9 nM，虽HKU5 Mpro的IC50值略高，但差异不显著，均在双位数纳摩尔范围。研究人员成功解析了HKU5-CoV-1 Mpro与nirmatrelvir复合物（1.91 ?，PDB ID: 9VVF）和ensitrelvir复合物（1.55 ?，PDB ID: 9WM7）的晶体结构。
*Structural basis of nirmatrelvir recognition by the HKU5-CoV-1 Mpro*
nirmatrelvir复合物结构证实其腈基弹头与催化Cys148形成共价硫代亚胺键。P1 γ-内酰胺通过氢键与His166和Glu169相互作用，P2 bicycloproline部分埋入S2疏水口袋。与apo结构相比，nirmatrelvir结合诱导S2环（残基45-51）局部重排，使Leu49向P2基团移动约3.6 ?，采用与SARS-CoV-2 Mpro复合物中Met49类似的构象。
*Structural basis of ensitrelvir binding to the HKU5-CoV-1 Mpro*
ensitrelvir复合物结构显示其非共价结合模式，核心1,3,5-三嗪-2,4-二酮环将P1′ 6-氯-2-甲基-吲唑、P1 1-甲基-1,2,4-三唑和P2 2,4,5-三氟苯基分别定位到S1′、S1和S2亚位点。P2芳香环与His41咪唑环形成面对面的π-π堆叠，P1′的6-氯取代基与Cys148的硫原子形成3.4 ?卤键。与nirmatrelvir复合物相比，S2口袋呈现重塑几何构型，His41向S2空腔旋转，Leu49向外位移约1.4 ?。
*Structural comparison with MERS-CoV Mpro*
与MERS-CoV Mpro的结构比较显示，HKU5-CoV-1和MERS-CoV共享Leu49（S2环）和Met25（S1′口袋），区别于SARS-CoV-2中的Met49和Thr25。两种抑制剂在HKU5-CoV-1和MERS-CoV Mpro中的结合模式总体保守，但MERS-CoV结构中相邻原体的Ser1在活性位点未被适当稳定。
*Modeling studies of the HKU5-CoV-2 Mpro complexed with inhibitors*
AlphaFold3预测的HKU5-CoV-2 Mpro-nirmatrelvir复合物模型经50 ns MD模拟后，整体结合模式与HKU5-CoV-1晶体结构高度相似。然而，AlphaFold3未能捕捉ensitrelvir结合的关键构象特征，特别是His41向S2口袋的向内旋转。研究人员改用晶体结构引导的建模策略，以HKU5-CoV-1 Mpro-ensitrelvir复合物结构为模板，构建了HKU5-CoV-2 Mpro-ensitrelvir模型并经MD模拟验证，成功获得了与实验结构一致的结合构象。
**总结与讨论**
讨论部分指出，尽管HKU5-CoV-1/2 Mpro在外围抑制剂结合亚位点存在局部序列差异，但仍对nirmatrelvir和ensitrelvir保持敏感性。S2和S4亚位点呈现清晰的物种特异性差异，HKU5-CoV-1 Mpro中S2环的固有柔性和扩展的S4空腔为设计更优的P4取代基提供了机会。与SARS-CoV-2中Met49相关的ensitrelvir抗性突变位点在HKU5-CoV-1中天然为Leu，提示局部环境可能微妙影响ensitrelvir识别。高分辨率结构揭示了活性位点中有序水分子网络，可被直接利用于抑制剂优化。建模工作同时强调了高分辨率实验结构在基于结构的药物设计中的不可替代性。
研究结论：这些数据在原子分辨率上定义了临床批准的Mpro抑制剂如何结合前出现merbecovirus HKU5-CoV-1的Mpro，并为HKU5-CoV-2 Mpro提供了结构和动态见解，揭示了可用于未来药物设计的保守和谱系/物种特异性特征。通过整合高分辨率晶体学、生物化学分析和建模，这项工作为开发针对HKU5相关merbecovirus的新一代Mpro抑制剂以及评估现有COVID-19 Mpro抑制剂的交叉反应潜力提供了框架。
