CaMKII 第 273 位半胱氨酸的 S-亚硝基化抑制心肌细胞内 CaMKII 的激活和流动性

《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：S-nitrosylation of CaMKII Cys273 suppresses CaMKII activation and mobility within cardiac myocytes

　　

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  Camui使能够在完整的心肌细胞中实时监测CaMKII的激活状态。
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  我们首次在心室心肌细胞中表明，CaMKIIδ上的Cys273位点对NO诱导的CaMKIIδ激活和移动性的抑制至关重要。
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  在电场刺激和Ca²⁺激活后，CaMKIIδ在Cys290位点的亚硝化作用增强了CaMKIIδ的活性。

引言

一氧化氮合酶（NOS）调节心肌细胞的基础收缩力和β-肾上腺素能反应性[1]，主要通过调节Ca²⁺稳态或肌丝Ca²⁺敏感性。NOS活性可受激酶调节——NOS1活性因钙/钙调蛋白激酶II（CaMKII）依赖性Ser 847磷酸化而降低，而NOS3激活因CaMKII在Ser1177位点的磷酸化而增加[2]、[3]。相反，CaMKII也受亚硝化作用调节，存在潜在的阳性反馈机制[4]、[5]、[6]。CaMKIIδ已被确认为心肌细胞离子通道门控、钙（Ca）调节、收缩和转录控制的关键调节因子，并且已知在多种病理状态下呈慢性激活[7]、[8]。临床前研究表明，急性或遗传性抑制CaMKIIδ可限制心律失常和心力衰竭（HF）的进展，从而确立了该激酶作为治疗靶点的地位[9]、[10]、[11]。这些因素使得了解CaMKIIδ在成人心肌细胞中受调节的详细机制变得至关重要。

CaMKIIδ作为全酶，主要由12个亚基组成，每个亚基有3个结构域：N端催化结构域、调节结构域和C端结合结构域[12]。结合结构域指导多聚体组装，结合形成全酶中的中心枢纽，并通过连接肽与调节结构域相连。调节结构域要么结合催化结构域（在其非活性状态下），要么结合钙调蛋白（CaM，在其活性状态下）。随着细胞内Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_i）的增加，调节结构域以10–50 nM的K_D结合Ca-CaM[13]。一旦Ca-CaM结合，CaMKIIδ采用开放的构象状态，使其能够磷酸化分子靶标，包括相邻CaMKIIδ亚基上的Thr287[13]。这种自磷酸化提高了Ca-CaM亲和力，并减慢失活或与催化结构域的重新结合——这也使得激酶能够独立于Ca-CaM而保持部分活性[14]、[15]。我们的Camui传感器利用这种“激活依赖性”的构象状态变化，来读出CaMKIIδ活性。其他翻译后修饰（PTM），包括氧化（Met281/Met282）、GlcNAc化（Ser280）和S-亚硝化（Cys290）同样可以触发这种自主活性[6]、[16]、[17]。

我们小组之前曾表明，一氧化氮（NO）对CaMKIIδ活性具有双重作用：虽然CaMKIIδ上Cys290的S-亚硝化促进了激酶的自主活性，但Cys273的S-亚硝化则抑制了Ca-CaM引起的激活[6]。S-亚硝化的差异效应取决于NO暴露相对于Ca-CaM结合的时间。也就是说，在低[Ca²⁺]下，Cys273处的S-亚硝化阻止了Ca-CaM依赖性激活（且Cys290位点不可用），但当CaMKIIδ已处于开放或活性状态时，Cys290的S-亚硝化促进了CaMKIIδ的自主活性。这表明在[Ca²⁺]波动的细胞（如心肌细胞）中，NO与CaMKII之间存在复杂的相互作用。S-亚硝化发生并改变心肌细胞Ca²⁺循环的分子机制，据推测是通过定位在肌浆网（SR）膜上的NOS1（nNOS，而不是NOS3或eNOS）发生的，在那里它激活局部CaMKII以磷酸化受磷蛋白（phospholamban）和兰尼碱受体（RyR），这可以增强SERCA对SR Ca的吸收速率并敏化SR Ca释放[18]、[19]。然而，CaMKIIδ亚硝化在心肌细胞中的（病理）生理作用仍知之甚少。此外，Cys273处的抑制在多大程度上能抑制SERCA或RyR激活尚不清楚。β-肾上腺素能刺激也可以通过不同于Ca/CaM激活的机制激活CaMKIIδ[20]、[21]、[22]、[23]。

在这里，我们使用我们基于FRET的CaMKII活性传感器Camui的突变CaMKIIδ变体[24]以及缺乏Cys273或Cys290 S-亚硝化位点的GFP标记CaMKIIδ构建体，评估了暴露于NO供体S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）后CaMKIIδ的激活和移动性。我们首次在心室心肌细胞中表明，在电场刺激和Ca²⁺或β-肾上腺素能激动剂激活之前，CaMKIIδ在Cys273位点的亚硝化抑制了CaMKIIδ的活性和移动性，而将Cys273突变为丝氨酸则减轻了这种效应。同样，我们发现防止CaMKIIδ在Cys290位点发生S-亚硝化会抑制GSNO促进自主活性状态的能力。突变的选择基于先前的生物化学验证以及在不严重破坏基础功能的情况下影响S-亚硝化能力的优势。

章节摘要

伦理审批

所有动物处理和实验室操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）的动物研究指南进行，并获得了加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会的批准（方案号：21572）。

心肌细胞分离和培养（腺病毒转染）

兔心肌细胞按照先前描述的方法从3-4个月大的年轻雄性新西兰白兔中分离出来[25]。简而言之，兔子在使用初始...诱导全身麻醉之前被注射了肝素（400 U/kg体重）。

不同激活状态下CaMKIIδ的寿命成像

Camui是一种激活依赖的基于FRET的传感器，用于评估CaMKIIδ从静息（自身抑制）到激酶激活状态的构象变化（图1A）。其C端和N端分别标记有GFP（供体）和RFP（受体）荧光基团，在闭合、非活性的CaMKIIδ构象中，这些标记之间的荧光共振能量转移（FRET）水平很高（图1A - 左）。在此状态下，激发GFP的能量转移至受体（RFP），导致供体...

讨论

虽然GSNO可以诱导多种形式的半胱氨酸修饰，但与野生型（WT）相比，C273S和C290A突变体效应的丧失表明这些特定残基上的S-亚硝化是主要机制，这与Erickson等人的研究结果一致[6]。

这里的数据表明，CaMKIIδ上的Cys273位点对NO诱导的成人心室肌细胞中CaMKIIδ激活和移动性的抑制至关重要。我们使用荧光生物传感器Camui测量荧光...来确定这一点。

CRediT作者贡献声明

Chidera C. Alim：撰写–审阅与编辑，撰写–原稿，可视化，项目管理，方法论，调查，形式化分析，数据整理，概念化。Wei-Lun Hsiao：形式化分析，调查，方法论，软件。Christopher Y. Ko：撰写–审阅与编辑，可视化，验证，监督，软件，方法论，形式化分析，概念化。Julie Bossuyt：撰写–审阅与编辑，资源，项目管理，资金

写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

作者在本手稿的开发过程中未使用生成式AI或AI辅助技术。

资金来源

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01-HL142282（D.M. Bers）、P01-HL141084（D.M. Bers）拨款的支持。

利益冲突声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

感谢Nima Rashid Habibi、Anastasia Krajnovic和Daria Smoliarchuk在心肌细胞分离方面提供的帮助。

Chidera C. Alim|Wei-Lun Hsiao|Christopher Y. Ko|Julie Bossuyt|Donald M. Bers