《Yeast》：Approaches to Superefficient Yeast Transformations: DNA Phase Separation, Cell Growth State and Systematic Experimental Design
编辑推荐：
酵母是真核模式生物和蛋白质生产宿主，其遗传操作的便捷性是其优势之一。自20世纪70年代以来，基于质粒或整合入基因组的DNA酵母转化方法已被开发，并成为许多实验室的常规技术。然而，转化频率出奇地低，在出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中常用
酵母是真核模式生物和蛋白质生产宿主，其遗传操作的便捷性是其优势之一。自20世纪70年代以来，基于质粒或整合入基因组的DNA酵母转化方法已被开发，并成为许多实验室的常规技术。然而，转化频率出奇地低，在出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中常用方法的转化细胞比例约为1%。在其他酵母物种中，转化频率更低，且可能需要不合理的大量输入DNA。令人惊讶的是，酵母细胞摄取DNA的机制尚不明确。本文认为，三种方法可显著提升酵母转化频率和效率。第一，探究DNA摄取的机制。标准方案中对盐类和外源聚合物（载体DNA和聚乙二醇(PEG)）的需求表明，DNA的相分离可能增强DNA进入细胞或后续递送至细胞核的过程。第二，考虑酵母的生理或生长状态，包括细胞周期阶段以及营养或胁迫条件。第三，利用统计实验设计(Design of Experiments, DoE)系统性地确定影响转化效率的因素。这些方法有望实现S. cerevisiae的超高效转化，并加速非模式酵母的遗传操作。
1 引言
酵母作为单细胞真菌，是科学研究和工程应用的重要模式生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可用于面包、酒类酿造，并能经工程化改造生产多种有用蛋白和化学品。其他酵母如毕赤酵母(Pichia/Komagataella)、耶氏酵母(Yarrowia)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)则可生产糖基化蛋白、脂质、燃料等代谢物。念珠菌(Candida)属包含重要人类病原体，而裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)作为模式生物推动了基础生物学发现。酵母的实用性很大程度上取决于其易于进行遗传操作即转化的特性。DNA摄取是所有遗传操作方法的关键环节，但现有方法效率低下。目前盐/聚合物法对S. cerevisiae的转化频率低于1%，电穿孔法约2%，远低于哺乳动物细胞的40%-95%。而在非模式酵母中，转化频率常低至0.1%或更低。DNA摄取是主要瓶颈，表现为每个细胞需要大量DNA分子。例如，高效转化需3000倍过量的DNA分子，而裂殖酵母的效率还要低100倍以上。这不仅增加成本，也限制了高通量应用。此外，载体DNA的使用虽能提升效率，但其片段可能意外整合入基因组，带来不良后果。因此，亟需将酵母转化效率提升数个数量级。
2 DNA摄取可能依赖于相分离
盐/聚合物法中DNA摄取依赖内吞膜内陷，但具体机制尚不完全清楚。研究人员提出新模型：锂盐(Li+)、载体DNA和聚乙二醇(PEG)共同作用导致DNA相分离，形成富含DNA的凝聚体，进而被酵母通过内吞作用摄取。该假说基于体外实验证据：PEG浓度高于6.5%、氯化钠(NaCl)浓度为0.55 M时可沉淀剪切鲑鱼DNA，这与转化条件相似。锂离子对DNA相分离有特别强的效应，解释了其在转化中的效用。该模型提出三个研究方向：第一，控制盐浓度、聚合物特性、pH、二甲基亚砜(DMSO)等因素，可调节DNA相分离并影响转化效率；第二，寻找替代聚合物以减少输入DNA用量或消除对载体DNA的需求；第三，利用脂质体或囊泡包裹DNA实现高效转化，类似于哺乳动物细胞的脂质体转染。已有商业试剂盒声称无需载体DNA即可达到同等转化效率，但其具体成分未公开。DNA从培养基到细胞核的完整路径仍不清楚，但推测凝聚体粒径约30-50 nm时有利于内吞，且需避免被分选至液泡降解，最终通过核孔复合体进入细胞核。凝聚体的解聚可能依赖于稀释盐和PEG，或与天然存在的DNA修复相关凝聚体相互作用。
3 生长阶段影响转化效率
酵母的生长状态显著影响转化效率。盐/聚合物法通常偏好对数生长期早期（约2代）的细胞，而稳定期细胞转化效率较低。这可能是由于不同生长阶段的内吞活性差异所致。对于涉及基因组编辑的转化，同源重组(Homologous Recombination, HR)是另一关键瓶颈。同源重组受细胞周期调控，在S. cerevisiae中仅于S期和G2期活跃。因此，非同步生长的群体中只有部分细胞处于高效转化状态。营养条件和细胞胁迫同样重要：近期研究发现，在最低培养基(YNB)而非丰富培养基(YPD)中培养的念珠菌细胞转化效率提高10倍，这与氧化应激和翻译机器下调相关；而添加氨基酸补充剂则可提升转化效率。理想情况是找到同时促进DNA摄取、核递送和同源重组的生长条件，可能需要对细胞周期进行同步化处理，并确保转化细胞的高回收率。
4 实验设计可提升转化效率
提升酵母转化效率需要系统探索众多参数的影响。影响盐/聚合物法的参数包括：输入DNA浓度、PEG分子量与浓度、载体DNA类型与浓度、盐种类与浓度、细胞生长阶段、培养基营养成分、热激时长等。这些参数之间存在交互作用，因此需要测试大量组合。统计实验设计(Design of Experiments, DoE)提供了一种框架，可在有限实验预算内最有效地采样多维参数空间，获取最大信息量。DoE已在多种生物学场景中得到有效应用，优于传统的单因素逐一优化方法。结合机制理解，DoE可为改进非模式酵母转化效率提供有效途径。
5 超高效酵母转化的时机已成熟
本文论证了酵母转化频率和效率存在数量级提升空间，并提出三条路线：通过操控DNA的生物物理状态增强摄取、通过调整细胞生长状态优化转化、以及运用实验设计系统改进效率。历史上，加入载体DNA使转化效率提升超过100倍，加入DMSO提升25倍，山梨醇(Sorbitol)的添加也实现了10倍提升。研究人员期望通过简单的方法改进，实现对S. cerevisiae的一个数量级提升，对非模式酵母则更为显著，从而加速酵母领域的生物学发现和生物技术发展。
