《Journal of Chromatography B》：Development, validation, and clinical application of a UPLC–MS/MS method for clobazam and
N-desmethylclobazam in paediatric refractory epilepsy
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开发并验证了一种快速、灵敏的UPLC–MS/MS方法，用于在50 μL儿童血浆中同时定量氯巴占（CLB）及其活性代谢物N-去甲氯巴占（N-CLB），单次分析运行时间仅为3分钟。该方法依据ICH M10指南核心要素完成验证，展现出可接受的灵敏度、准确
专业翻译：
开发并验证了一种快速、灵敏的UPLC–MS/MS方法，用于在50 μL儿童血浆中同时定量氯巴占（CLB）及其活性代谢物N-去甲氯巴占（N-CLB），单次分析运行时间仅为3分钟。该方法依据ICH M10指南核心要素完成验证，展现出可接受的灵敏度、准确度和精密度。研究人员将该方法应用于61例接受氯巴占辅助治疗的儿童难治性癫痫患者，以考察药物浓度的影响因素。研究结果显示，CLB浓度与每日剂量及合并使用丙戊酸（VPA）或司替戊醇（STP）独立相关，而N-CLB浓度则与CYP2C19慢代谢（PM）表型及合并使用司替戊醇独立相关。上述发现提示，将CLB和N-CLB的治疗药物监测（TDM）与CYP2C19基因分型及合并用药评估相结合，可能有助于指导中国儿童难治性癫痫患者的个体化给药方案。
论文解读
一、研究背景与问题
氯巴占（CLB）是一种1,5-苯二氮卓类药物，通过作用于γ-氨基丁酸A型（GABAA）受体的α亚基发挥镇静作用，2011年获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于两岁及以上Lennox–Gastaut综合征（LGS）患者的辅助治疗，此后被广泛用于LGS、Dravet综合征、肌阵挛-站立不能性癫痫及其他难治性癫痫。CLB口服后吸收迅速，1–4小时达血药峰浓度，主要经肝脏去甲基化代谢为活性代谢物N-去甲氯巴占（N-CLB），后者进一步代谢为无活性产物。与CLB相比，N-CLB消除半衰期显著更长而内在活性较低，因此在长期治疗中对药物持续效应贡献显著。
CLB和N-CLB血药浓度的个体间差异受细胞色素P450（CYP）酶基因多态性、合并用药及其他患者相关因素影响。CYP3A4是介导CLB去甲基化生成N-CLB的主要肝微粒体酶，其*1G等位基因在中国人群中频率约24%；CYP2C19则是介导N-CLB羟基化灭活的主要酶，存在显著基因多态性，个体被分为超快代谢（UM）、快代谢（RM）、正常代谢（NM）、中间代谢（IM）和慢代谢（PM）表型。值得注意的是，亚洲人群中18–23%为CYP2C19慢代谢者，其N-CLB血药浓度可达正常代谢者的3–5倍，增加镇静、头晕、共济失调等不良反应风险。此外，难治性癫痫患儿常合并使用多种抗癫痫药物（ASMs），其中部分为CYP3A4或CYP2C19的抑制剂/诱导剂，可能进一步影响CLB和N-CLB的药代动力学。
2017年精神病学治疗药物监测（TDM）共识指南推荐在有临床指征的患者中监测CLB和N-CLB。既往已采用气相色谱、高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）和高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）等方法实现两者同时定量，但这些方法存在样品前处理繁琐、分析时间长、所需样本量大等局限，且灵敏度和特异性不足，难以在采血量有限的儿科患者中可靠应用。液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）因其卓越灵敏度和选择性被广泛视为多种药物TDM的金标准。因此，本研究旨在开发并验证一种灵敏、便捷、稳健的LC–MS/MS方法，用于人血浆中CLB和N-CLB的同时定量，并探讨CYP3A4和CYP2C19基因多态性及合并ASMs与中国儿童难治性癫痫患者血浆CLB和N-CLB浓度的关联，以支持个体化临床治疗。
二、研究内容与结论
研究人员开发并验证了一种基于UPLC–MS/MS的检测方法，实现了在50 μL血浆中3分钟内同时定量CLB和N-CLB，并依据ICH M10指南完成方法学验证。将该方法应用于61例儿童难治性癫痫患者的临床样本，结合CYP3A4和CYP2C19基因分型及合并用药信息，通过单因素和多因素线性回归分析，识别了影响CLB和N-CLB血药浓度的独立预测因素。研究结论表明，CLB浓度与每日剂量及合并使用丙戊酸（VPA）或司替戊醇（STP）独立相关，而N-CLB浓度与CYP2C19慢代谢表型及合并使用STP独立相关。将CLB和N-CLB的TDM与CYP2C19基因分型及合并用药评估相结合，可能有助于指导中国儿童难治性癫痫患者的个体化给药。
三、关键技术方法
本研究采用ACQUITY UPLC-Class/Xevo TQD LC–MS/MS系统，以ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱实现色谱分离，正离子电喷雾电离（ESI）结合多反应监测（MRM）模式进行质谱检测。血浆样本仅需50 μL，采用乙腈一步蛋白沉淀法进行前处理，以CLB-d3和N-CLB-d5为同位素内标。方法依据ICH M10指南完成选择性、线性、精密度与准确度、回收率与基质效应、稀释完整性、残留及稳定性等全面验证。临床部分纳入2024年9月至2025年6月期间苏州大学附属儿童医院确诊为难治性癫痫且规律服用CLB辅助治疗的61例患儿，血样于下次给药前1小时内采集，采用高通量测序技术检测CYP3A4 * 1G（rs2242480）、CYP2C19 * 2（rs4244285）和CYP2C19 * 3（rs4986893）多态性。
四、研究结果
方法开发与LC–MS/MS优化：通过比较不同电离模式，最终选择正离子MRM模式。CLB、CLB-d3、N-CLB和N-CLB-d5的质子化前体离子分别为m/z 301.22、304.22、287.22和292.22。色谱条件经优化后，CLB和CLB-d3的保留时间分别为1.33和1.32分钟，N-CLB和N-CLB-d5均为1.15分钟，总分析时间缩短至3分钟。该方法较既往报道具有显著优势：分析时间大幅缩短、血浆用量仅需50 μL、一步蛋白沉淀法较传统液液萃取或固相萃取更简便省时。
方法验证：选择性评估显示，空白血浆在分析物和内标保留时间处无显著干扰峰，溶血（2%，v/v）和脂血（甘油三酯>300 mg/dL）血浆中准确度均在±15%以内，CV≤9.65%。CLB在25–800 ng/mL、N-CLB在237.5–7600 ng/mL范围内线性良好，相关系数均大于0.99。日内和日间准确度与精密度均符合接受标准。CLB和N-CLB的平均提取回收率分别为107.07–108.05%和103.02–105.49%，内标归一化基质因子接近1（0.996–1.015），表明基质效应可忽略。稀释完整性评估显示准确度和精密度均符合要求，残留评估显示无明显残留。稳定性评估表明，CLB和N-CLB在储备液和血浆样本的各测试条件下均稳定。
临床应用与浓度影响因素分析：61例患儿中，CLB平均血药浓度为211.38±120.97 ng/mL，N-CLB平均浓度为2604.02±2313.07 ng/mL，其中3例N-CLB浓度超过定量上限7600 ng/mL，经稀释后复测。CYP3A4基因分型显示CC、CT、TT基因型频率分别为63.93%、31.15%和4.92%；CYP2C19表型中NM、IM、PM分别占34.43%、47.54%和18.03%。合并用药方面，丙戊酸（VPA）最常用（72.13%），其次为吡仑帕奈（31.15%）、托吡酯（29.51%）、司替戊醇（STP）（9.84%）和奥卡西平（9.84%）。CLB浓度与每日总剂量显著正相关（Spearman ρ=0.526，P<0.001），但与体重归一化剂量无显著相关；N-CLB浓度与两种剂量均无显著相关。CLB浓度CV为57.23%，N-CLB浓度CV达88.83%，提示显著的个体间药代动力学变异。81.97%的患儿CLB浓度在目标范围（30–300 ng/mL）内，仅67.21%的患儿N-CLB浓度达到推荐范围（300–3000 ng/mL）。
CYP3A4基因型分层分析显示，CC、CT、TT三组间CLB浓度及浓度/剂量比均无显著差异，但TT纯合子仅3例，样本量过小限制了可靠的三组统计比较。CYP2C19表型分层分析显示，PM组N-CLB浓度显著高于NM和IM组（PM vs NM：P<0.001；PM vs IM：P<0.0001），中位数分别为5846.10 ng/mL、1602.00 ng/mL和1454.60 ng/mL；NM与IM间无显著差异。N-CLB/CLB比值在PM组（中位数54.11）显著高于NM组（6.40）和IM组（6.26）（均P<0.0001），PM组中位数N-CLB浓度和N-CLB/CLB比值分别约为NM组的3.6倍和8.5倍。
多因素线性回归分析显示，CLB每日剂量与CLB浓度正相关（β=5.75，95% CI：3.01–8.49），合并VPA与较低CLB浓度显著相关（β=?88.37，95% CI：?134.43至?42.31），合并STP与显著升高的CLB浓度相关（β=206.29，95% CI：137.11–275.47），模型解释59.0%的CLB浓度变异。敏感性分析显示，排除接受STP的患者后，每日剂量和VPA与CLB浓度的关联仍显著。对于N-CLB浓度，CYP2C19 PM表型（β=4354.34，95% CI：3259.61–5449.07）和合并STP（β=3005.10，95% CI：1740.35–4269.84）均与显著升高的N-CLB浓度独立相关，模型解释61.1%的变异。VPA与N-CLB浓度无显著关联。HC3稳健标准误检验进一步证实了STP和CYP2C19 PM状态与N-CLB浓度的显著关联。敏感性分析显示，排除接受STP的患者和PM表型患者后，上述关联仍保持显著。
五、讨论与结论
讨论部分指出，VPA与较低CLB浓度的关联可能源于两者均具有高蛋白结合率，蛋白结合置换可能增加CLB游离分数，从而改变其分布和消除；但作为观察性研究，残余混杂（包括适应证混杂）和潜在反向因果无法完全排除。STP与CLB和N-CLB浓度升高的关联具有生物学合理性，因STP对CYP3A4和CYP2C19均有抑制作用。CYP2C19 PM表型与N-CLB浓度显著相关，与既往日本和中国儿童人群药代动力学研究结果一致。研究局限性包括单中心设计、样本量有限、CYP3A4 TT携带者仅3例、合并ASMs以二分类变量编码而未纳入剂量信息、未进行 incurred sample reanalysis（ISR）等。
结论部分翻译：本研究开发并验证了一种灵敏的UPLC–MS/MS方法，用于人血浆中CLB和N-CLB的同时定量。该方法所需样本量小、运行时间短，非常适合儿童难治性癫痫患者的常规TDM。临床应用揭示了药物浓度的显著个体间变异。多因素分析显示，CLB每日剂量、合并VPA和STP与CLB浓度显著相关，而CYP2C19 PM状态和STP与更高的N-CLB浓度显著相关。上述发现提示，TDM联合CYP2C19基因分型可能有助于实现CLB个体化给药并改善治疗安全性，尤其对于接受多药治疗的CYP2C19慢代谢中国儿童患者。
