基于干血斑的Alinity m HIV-1检测在资源有限地区早期婴儿诊断中的应用评估

《Journal of Clinical Virology Plus》：Evaluation of the Alinity m HIV-1 Assay for Early Infant Diagnosis Using Dried Blood Spots in Resource-Limited Settings

　　

摘要：全球相当大比例的HIV感染儿童在诊断、治疗获取和病毒抑制方面仍落后于成人，凸显了儿科HIV照护中持续存在的差距。尽管许多孕妇接受抗逆转录病毒治疗以预防传播，且大多数暴露婴儿接受了早期检测，但及时的诊断和出生后立即启动治疗至关重要，因为早期治疗可显著降低死亡率。在资源有限的环境中，干血斑（DBS）通过简化从偏远地区到中心实验室的标本采集、储存和运输提供了一种实用解决方案。在本研究中，研究人员评估了Alinity m HIV-1检测的分析性能和临床性能，该检测是一种支持DBS进行定性早期婴儿诊断（EID）的实时PCR检测。该检测的检出限（LOD）为392.68拷贝/mL，在2.60、3.60、5.00和7.30 Log拷贝/mL浓度下的重复性总标准差≤1.00个循环，样本在?20°C至31°C储存长达12周后仍具有100%的检出率，且在3x和10x LOD下循环数变化最小。对391份标本的临床评估显示与比较检测方法的一致性为100%，循环数相关系数（r）为0.905，循环数范围为19.42至36.90。总体而言，这些结果证明了Alinity m DBS EID HIV-1检测在HIV-1早期婴儿诊断中的实用性。

基于干血斑的Alinity m HIV-1检测在资源有限地区早期婴儿诊断中的应用：一项系统评估

一、研究背景与目的

2024年，全球估计有140万名年龄≤14岁的儿童感染HIV，其中86%居住在撒哈拉以南非洲。尽管全球在HIV防治方面取得了进展，但儿童在实现UNAIDS 95-95-95目标方面仍落后于成人：成人中88%了解自身HIV状态，78%接受抗逆转录病毒治疗（ART），74%达到病毒抑制，而儿童中相应比例仅为63%、55%和47%。虽然84%的HIV感染孕妇获得了预防母婴传播（MTCT）的抗逆转录病毒药物，但早期婴儿诊断（EID）的缺口仍然存在，仅有65%的HIV暴露婴儿在出生后两个月内接受检测。

HIV感染可在妊娠、分娩或母乳喂养期间发生，未治疗感染与高死亡率相关。出生后三个月内启动ART的婴儿与较晚启动治疗的婴儿相比，HIV相关死亡率可降低最多76%。因此，及时准确的诊断检测是儿科HIV照护的基石。世界卫生组织（WHO）建议所有HIV暴露婴儿在4-6周龄或此后最早时机进行病毒学检测，并考虑在高风险环境中进行出生检测。对于18个月以下的儿童，WHO建议对HIV或其成分（HIV RNA、HIV DNA或超灵敏HIV p24抗原）的初始阳性病毒学检测结果，需在另一份独立标本上进行第二次病毒学检测以确认。由于母体抗体可能持续存在并干扰判读，不推荐对18个月以下儿童使用血清学检测进行确认诊断。

然而，在许多低收入和中等收入国家（LMICs），EID的实施受到实验室基础设施有限、标本运输延迟和失访的挑战。干血斑（DBS）通过促进从分散环境到中心实验室的标本采集、储存和运输，提供了血浆检测的实用替代方案。Alinity m HIV-1检测是一种实时PCR检测，能够处理多种标本类型，包括用于定量病毒载量监测和定性EID检测的DBS。本研究旨在评估Alinity m DBS EID HIV-1检测（Alinity m EID）的分析性能和临床性能，以评估其支持EID项目的实用性。

二、研究方法概述

研究人员在Alinity m系统上执行Alinity m EID检测，其引物和探针靶向病毒基因组的整合酶和LTR区域。检测结果针对10个未读循环进行了调整。比较检测采用cobas? HIV-1/HIV-2定性检测（cobas HIV-1/2），在cobas? 6800/8800系统上进行，靶向gag和LTR区域，其DBS检出限（LOD）声称值为255拷贝/mL。DBS卡片制备和样本洗脱按照制造商说明书进行，将全血点样于12mm圆圈（至少70μL），室温风干至少3小时，并在1.3 mL Alinity m DBS缓冲液中于55°C孵育30分钟洗脱。LOD研究使用了WHO第三代HIV-1 RNA国际标准品（10/152，B亚型）稀释系列制备的DBS panel，浓度范围为50至500拷贝/mL，每个panel成员共96个重复，使用4个试剂批次在3天内进行检测，每天每试剂批8个重复，通过Probit回归模型估计LOD。重复性研究包含1个阴性和4个阳性panel成员（浓度分别为2.60、3.60、5.00和7.30 Log copies/mL），每个成员每天两次运行5个重复，使用3个不同批次的AMP试剂在3台仪器上进行至少5天测试，计算批内、批间、日间和仪器间标准差（SD），总SD为上述组分之和。样本稳定性研究中，10名独特供体的HIV阴性全血以约3x LOD（3.08 Log copies/mL）和10x LOD（3.60 Log copies/mL）加标HIV-1病毒储存液，点样于DBS卡片后储存在?20°C、2–8°C、15°C、26°C和31°C（环境湿度）及45°C/85%湿度条件下，在8、10、12周时检测。临床标本评估使用了从中央公共卫生实验室（CPHL，ISO:15189认可且符合GCP）获得的剩余去标识常规临床标本，方案经乌干达国家卫生实验室服务研究伦理委员会（UNHLS-REC）批准并在乌干达国家科学技术委员会（UNCST）注册。根据乌干达卫生部EID检测算法，HIV暴露婴儿在4-6周龄接受病毒学检测，阳性婴儿立即启动ART，阴性婴儿在9个月、18个月和停止母乳喂养后6周重复检测。按照WHO指南TSS-12，用于HIV-1和HIV-2核酸定性检测的体外诊断医疗器械应至少评估100名个体，包括至少25份阳性标本。本研究共纳入391份指尖血DBS标本，包括214份HIV-1阴性和177份HIV-1阳性标本，来自HIV暴露的18个月以下婴儿和儿童，年龄1至16个月（平均7个月），其中女性203名（52%），男性188名（48%）。HIV-1状态使用cobas HIV-1/2检测（作为记录检测，TOR）确定，同一DBS卡上的斑点用于两种检测，仅纳入两种检测均有效的Alinity m EID和cobas HIV-1/2结果进行比较。

三、主要研究结果

（一）检出限（LOD）

包含6个成员的panel（50至500拷贝/mL）在400拷贝/mL时显示>95%检出率（91/94，96.8%），在500拷贝/mL时为100%检出（94/94，100%）。Probit分析计算Alinity m EID检测的LOD为392.68拷贝/mL（95%置信区间：323.35, 508.86）。靶向400拷贝/mL的panel成员平均循环数（CN）值为37.12。

（二）重复性

四个阳性panel成员均获得至少149个有效结果。2.60 Log copies/mL浓度的panel成员检出率为99.3%（149/150），而3.60、5.00和7.30 Log copies/mL浓度检出率为100%。所有panel成员的目标CN总标准差≤1.00个循环。阴性panel成员的所有重复均与预期结果100%一致。

（三）样本稳定性

在?20°C、2–8°C、15°C、26°C和31°C环境湿度条件下储存8、10和12周后，含有3x LOD和10x LOD HIV-1的DBS样本检出率均为100%。12周后，相对于对照条件的循环数差异在3x LOD时≤0.31个循环，在10x LOD时≤0.41个循环。在高湿度条件（26°C下85%相对湿度4周）下，检测性能未受不利影响。额外在仪器上放置4小时也未影响检测性能。在所有条件下，所有样本均被成功检出，CN值保持在相应对照条件的0.51个循环以内。

（四）临床性能

共评估了391份标本以比较Alinity m EID与cobas HIV-1/2的性能。在cobas HIV-1/2为HIV-1阴性的214份标本中，全部214份（100%）在Alinity m EID上也为阴性。在cobas HIV-1/2检出HIV-1的177份标本中，全部177份（100%）也在Alinity m EID上检出。Cohen's kappa计算为1.00，表示两种检测之间完全一致。Alinity m EID的CN值范围为19.42至36.90，中位CN值为28.23。两种检测的CN值比较显示相关性系数（r）为0.905（y=0.92x-0.52），Alinity m EID报告的HIV-1 CN值平均比cobas HIV-1/2早2.90个循环。Alinity m EID检出了检测实验室归类为低阳性（cobas HIV-1/2 CN值>30循环）的全部108份标本。

四、讨论与结论

本研究证明了Alinity m EID检测具有良好的分析性能和临床性能，支持其在无法获得常规血浆检测环境中的EID适用性。该检测实现了392.68拷贝/mL的LOD，在≥400拷贝/mL时检出率≥95%，表明具有足够的灵敏度来可靠识别HIV-1感染婴儿，包括低水平病毒载量的婴儿。所有测试浓度下的重复性均较高，总变异性≤1.00个循环，表明检测性能一致。

DBS的一个关键优势是标本从偏远采集点运输至中心实验室期间的稳定性。在本研究中，DBS样本在环境湿度下于?20°C至31°C温度范围储存长达12周仍保持稳定，CN相对于对照条件无延迟。经受高湿度或额外4小时仪器上时间的样本，其CN值在对照的0.51个循环以内，表明对检测性能影响极小。这些发现进一步验证了DBS标本的稳健性及其适用于分散式样本采集和运输模式，特别是在资源受限环境中，因为在这些环境中受控储存条件和及时样本处理往往难以实现。

临床性能评估显示Alinity m EID检测与cobas HIV-1/2完全一致。这种一致性水平表明该检测与已建立的参考方法性能相当，支持其在婴儿HIV-1定性检测中的可靠性。此外，两种平台间CN值的相关性（r≈0.91）进一步支持了病毒检测的一致性，尽管Alinity m检测平均在更早的CN时检出HIV-1，这一差异可能反映了检测设计的不同，如提取效率、引物/探针设计等。

这些发现在全球儿科HIV诊断差距的背景下尤为重要。尽管预防母婴传播（MTCT）取得了进展，但仅有65%的HIV暴露婴儿在出生后前两个月内接受检测，儿童在实现HIV诊断和治疗目标方面继续落后于成人。及时的EID至关重要，因为早期启动抗逆转录病毒治疗可显著降低HIV相关死亡率。然而，许多低收入和中等收入国家EID项目的实施仍受限于实验室基础设施不足、标本运输延迟和失访。使用DBS标本，结合Alinity m系统等高度敏感且可重复的分子平台，为解决这些障碍提供了一种实用方法。

综上所述，这些发现表明Alinity m EID检测具有稳健的分析灵敏度、重复性和标本稳定性，与cobas HIV-1/2检测具有100%临床一致性和强相关性。更广泛地采用此类技术有望扩大及时诊断和治疗的可及性，有助于改善儿科HIV结局并推动全球HIV消除目标的进展。