《Journal of Clinical Virology》：Clinical performance evaluation of a high-throughput real-time PCR platform for congenital cytomegalovirus screening on saliva swabs with quantitative reporting thresholds
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先天性巨细胞病毒（CMV）是常见的先天性病毒感染，在美国影响0.3%-0.6%的新生儿，是感音神经性听力损失（SNHL）和神经发育障碍的主要原因。虽然仅有10%的感染婴儿出生时表现为症状性疾病，但高达15%的无症状婴儿后续仍会发展为某种形式的SNHL。这些风险
先天性巨细胞病毒（CMV）是常见的先天性病毒感染，在美国影响0.3%-0.6%的新生儿，是感音神经性听力损失（SNHL）和神经发育障碍的主要原因。虽然仅有10%的感染婴儿出生时表现为症状性疾病，但高达15%的无症状婴儿后续仍会发展为某种形式的SNHL。这些风险推动了先天性CMV（cCMV）筛查的日益普及，截至2024年，美国已有13个州立法实施某种形式的新生儿cCMV筛查。然而，目前实践存在差异：58.2%接受调查的美国医院报告有任何筛查项目，其中仅11.2%实施普遍筛查。关于成本、最佳检测策略、治疗影响和过度诊断的担忧持续存在。准确诊断cCMV要求在出生后21天内采集标本，以区分先天性感染与产后感染。定性核酸扩增检测（NAAT），包括唾液和尿液的聚合酶链反应（PCR），构成当前筛查和诊断方法的基础，唾液因采集简便且敏感性高（>97%）而受到青睐。然而，唾液检测易受母乳或生殖道分泌物中母体CMV污染导致的假阳性结果影响，通常与低病毒载量相关。各项唾液CMV筛查研究报告的阳性预测值（PPV）范围为8%-90%，取决于采集方法、检测方法和患病率。因此，建议进行确认性尿液检测以确立cCMV诊断，尽管新生儿尿液标本采集在后勤上具有挑战性且具有侵入性。目前有两种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的用于新生儿cCMV筛查的检测方法，但两者的通量均相对较低（每批次最多8-10个样本）。这些局限性凸显了对能够在保持高敏感性的同时提高特异性和可扩展性以用于人群水平应用的检测方法的需求。研究人员所在机构在cobas 8800平台上验证了cobas CMV检测方法（罗氏诊断，印第安纳波利斯），作为针对新生儿唾液和尿液标本的实验室开发检测。研究人员首先描述了该平台在定性报告时用于cCMV筛查的分析和临床性能特征。研究人员进一步假设，唾液CMV病毒载量较高的婴儿更可能具有真正的先天性cCMV感染，并且通过应用病毒载量报告阈值可以提高基于唾液的筛查的特异性和阳性预测值。本研究旨在确定唾液CMV病毒载量阈值是否能够区分真正的cCMV感染与假阳性筛查结果。研究人员对2023年4月至2026年1月期间在克利夫兰诊所接受cCMV筛查的6,583名婴儿进行了回顾性队列分析。共有78名具有配对唾液和尿液CMV检测的婴儿纳入分析，包括29例真阳性（TP）、21例假阳性（FP）和28例真阴性（TN）唾液CMV PCR结果。假阳性唾液标本中76%在低于检测定量下限（LLOQ）的<35 IU/mL水平被检出，而真阳性唾液标本的中位病毒载量显著更高，为4.09×106（8.02×104-7.61×106）IU/mL（p<0.001）。当所有定性检出的CMV结果均报告为阳性时，唾液CMV PCR具有100%敏感性、57.1%观察特异性和99.7%推定特异性。仅将可定量结果（CMV≥35 IU/mL）分类为阳性可将观察特异性提高至89.8%，敏感性略有下降至96.6%。研究人员确定76 IU/mL为最佳截断值，在数据集中产生96.6%敏感性和100.0%观察特异性。在假设cCMV患病率为0.25%-1.5%时，该76 IU/mL截断值提供了估计100%的PPV。研究发现，现代CMV NAAT在唾液中的分析敏感性可能超过检测大多数真阳性病例所需水平，调整报告阈值可提高临床特异性。研究结论认为，cobas CMV检测方法在3 mL通用转运培养基（UTM）中采集的唾液拭子上具有可接受的cCMV筛查性能特征，并且通过应用病毒载量阳性报告阈值或“临界”范围可进一步提高特异性和PPV。
先天性巨细胞病毒唾液筛查的临床性能评估与病毒载量报告阈值优化——基于高通量实时PCR平台的研究解读
一、研究背景与问题
先天性巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）是最常见的先天性病毒感染，在美国影响0.3%-0.6%的新生儿，是感音神经性听力损失（sensorineural hearing loss, SNHL）和神经发育障碍的主要病因。虽然仅约10%的感染婴儿出生时表现为症状性疾病，但高达15%的无症状婴儿后续仍会发展为某种形式的SNHL。这些风险推动了先天性CMV（congenital CMV, cCMV）筛查的日益普及，截至2024年美国已有13个州立法实施某种形式的新生儿cCMV筛查。然而，当前实践存在显著差异，仅有58.2%接受调查的美国医院报告有任何筛查项目，其中仅11.2%实施普遍筛查。关于成本、最佳检测策略、治疗影响和过度诊断的担忧持续存在。
准确诊断cCMV要求在出生后21天内采集标本以区分先天性感染与产后感染。定性核酸扩增检测（nucleic acid amplification testing, NAAT），包括唾液和尿液的聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR），构成当前筛查和诊断方法的基础。唾液因采集简便且敏感性高（>97%）而受到青睐，但唾液检测易受母乳或生殖道分泌物中母体CMV污染导致的假阳性结果影响，通常与低病毒载量相关。各研究报道的唾液CMV筛查阳性预测值（positive predictive value, PPV）范围为8%-90%。目前两种美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准的用于新生儿cCMV筛查的检测方法通量均相对较低（每批次最多8-10个样本）。这些局限性凸显了对能够在保持高敏感性的同时提高特异性和可扩展性的检测方法的需求。因此，研究人员开展本研究，旨在评估cobas CMV检测方法在高通量cobas 8800平台上的临床性能，并探究唾液CMV病毒载量阈值能否区分真正的cCMV感染与假阳性筛查结果。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员在克利夫兰诊所（Cleveland Clinic）开展了一项回顾性队列分析，纳入2023年4月至2026年1月期间接受cCMV筛查的6,583名≤21天婴儿。研究采用混合筛查算法：在新生儿病房进行针对性筛查，在新生儿重症监护病房进行普遍筛查。唾液样本采集使用植绒拭子置于3 mL通用转运培养基（universal transport media, UTM）中，尿液样本在采集后24小时内以1:1体积比稳定于cobas PCR培养基中。cobas CMV检测方法在cobas 8800平台上作为实验室开发检测（laboratory-developed test）于2022年11月完成验证。定性CMV检测结果（检出或未检出）作为常规临床报告；对于唾液初始检出但低于定量下限（lower limit of quantification, LLOQ）的样本，进行重复检测共三次，报告多数结果。定量病毒载量值未用于临床决策。研究以尿液CMV PCR作为参考标准，将唾液结果分类为真阳性（true positive, TP）、假阳性（false positive, FP）、真阴性（true negative, TN）或假阴性（false negative, FN），计算敏感性、特异性、PPV和阴性预测值（negative predictive value, NPV）及其95% Clopper-Pearson置信区间。通过约登指数（Youden index）确定最佳截断值。对于唾液阴性且无尿液确认的婴儿，将其归类为推定真阴性（presumed TN）以计算推定特异性和NPV。使用Wilcoxon秩和检验比较真阳性与假阳性的唾液病毒载量，使用Spearman秩相关系数评估唾液与尿液病毒载量相关性。
三、研究结果
3.1 研究人群
在34个月研究期间，共6,583名≤21天婴儿接受唾液拭子CMV PCR筛查。其中51名（0.77%）婴儿唾液检出CMV，50名在≤21天龄接受了确认性尿液CMV PCR检测。1名婴儿因尿液检测发生在26天龄而被排除分析。6,532名唾液阴性婴儿中，28名在≤21天龄进行了尿液CMV PCR检测，结果均为阴性。另有23名唾液阴性但尿液检测超过21天龄的婴儿被排除，其中6名尿液阳性者经临床判定为产后获得性CMV感染。
3.2 唾液CMV PCR临床性能特征
共有78名具有配对唾液和尿液CMV检测的婴儿纳入分析，包括29例TP（唾液阳性、尿液阳性）、21例FP（唾液阳性、尿液阴性）和28例TN（唾液阴性、尿液阴性）。假阳性唾液标本中16/21（76%）在低于LLOQ的<35 IU/mL水平检出，范围为<35至65 IU/mL。真阳性唾液标本的中位病毒载量显著更高，为4.09×106（8.02×104-7.61×106）IU/mL（p<0.001）。在28名具有临床数据的TP婴儿中，46%仅有cCMV感染无任何症状或SNHL，7%为cCMV伴孤立性SNHL，18%为轻度cCMV疾病，29%为中重度cCMV疾病。中重度cCMV疾病组的中位唾液病毒载量最高，为6.27×106 IU/mL。唾液与尿液病毒载量呈统计学显著的中度正相关（相关系数0.67，p<0.001）。
3.3 最佳唾液CMV PCR报告阈值
当所有定性检出结果（包括低于LLOQ的结果）均报告为阳性时，唾液CMV PCR具有100%敏感性、57.1%观察特异性和99.7%推定特异性。仅将可定量结果（CMV≥35 IU/mL）分类为阳性可将观察特异性提高至89.8%，敏感性略有下降至96.6%。研究人员确定76 IU/mL为最佳截断值，产生96.6%敏感性和100.0%观察特异性。将截断值提高至100 IU/mL未进一步改善观察特异性，但敏感性降至93.1%。在假设cCMV患病率为0.25%-1.5%时，76 IU/mL截断值提供估计100%的PPV。被该阈值遗漏的1名真阳性婴儿的唾液病毒载量为<35 IU/mL，尿液病毒载量为68 IU/mL。
四、讨论与结论
研究发现，cobas CMV检测方法在3 mL UTM中采集的唾液拭子上具有可接受的cCMV筛查性能特征。使用“任意量检出”阈值时，唾液PCR敏感性为100%，PPV为58%，优于FDA批准的Simplexa先天性CMV Direct检测方法（44%）和Alethia CMV检测方法（8%-78%）。研究结果表明，现代CMV NAAT在唾液中的分析敏感性可能超过检测大多数真阳性病例所需水平，调整报告阈值可提高临床特异性。应用76 IU/mL阈值虽会遗漏1名无症状且随访14个月未出现SNHL迹象的婴儿，但消除了21例假阳性结果及其带来的确认性尿液采集负担。研究人员建议实验室考虑分层报告策略，设立“临界”范围以提示不确定性，而高于验证阈值的阳性结果可提示转诊随访。研究局限性包括混合筛查方法、单实验室检测、配对样本量相对较小以及6,481名唾液阴性婴儿缺乏尿液检测。研究结论认为，cobas CMV检测方法在唾液拭子上具有可接受的cCMV筛查性能，通过应用病毒载量阳性报告阈值或“临界”范围可进一步提高特异性和PPV，建议实施CMV唾液NAAT的实验室进行类似分析以确定替代报告阈值是否可提高诊断准确性。
