通过ID3 mRNA递送重编程肿瘤相关巨噬细胞以增强胰腺癌的免疫治疗

《Journal of Controlled Release》：Reprogramming tumor-associated macrophages via ID3 mRNA delivery for enhanced immunotherapy in pancreatic cancer

甘露糖修饰的LNP促进ID3 mRNA优先递送至TAM。ID3表达降低SIRPα水平并增强巨噬细胞吞噬作用。MLNP-ID3促进胰腺导管腺癌中促炎性巨噬细胞重编程。MLNP-ID3增强与抗PD-1疗法的联合活性。胰腺导管腺癌（PDAC）仍然是最致命的恶性肿瘤之一，其五年生存率始终仅约10% [1], [2]。由于缺乏早期临床症状，超过80%的患者在确诊时已处于局部晚期或转移性阶段，此时治愈性手术切除已不再可行 [3], [4]。目前的一线治疗策略，主要是FOLFIRINOX、NALIRIFOX（5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、脂质体伊立替康、亚叶酸）和吉西他滨联合白蛋白紫杉醇等联合化疗方案，仅提供有限的生存获益 [5], [6]。近年来，靶向程序性死亡受体1（PD-1）/程序性死亡受体配体1（PD-L1）轴的免疫检查点抑制剂在黑色素瘤和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中彻底革新了癌症治疗 [7], [8]，然而其在PDAC中的疗效仍然极其有限 [9]。这种耐药性在很大程度上归因于PDAC独特的肿瘤微环境（TME），其特征是致密的促纤维增生性间质以及深度免疫抑制性的髓系富集环境，这些特征共同限制了有效的抗肿瘤免疫反应 [10], [11], [12]。因此，能够有效地重塑免疫抑制性TME的策略代表了PDAC中关键的未满足临床需求。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是PDAC微环境中占主导地位的免疫细胞群体，在肿瘤免疫逃逸中发挥着关键作用 [13], [14]。在低氧和肿瘤来源因子的作用下，TAMs倾向于极化为免疫抑制性巨噬细胞状态，通过分泌抑制性细胞因子（包括白介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β））来抑制细胞毒性T细胞活性 [15], [16]。此外，TAMs表达高水平的信号调节蛋白α（SIRPα），其与肿瘤细胞上的分化簇47（CD47）相互作用，传递"不要吃我"信号，从而抑制巨噬细胞介导的吞噬作用 [17]。因此，CD47-SIRPα轴已成为一种关键的天然免疫检查点，使肿瘤细胞能够逃避巨噬细胞清除 [18], [19], [20]。尽管靶向CD47的治疗性抗体已显示出令人鼓舞的抗肿瘤活性，但其临床应用受到血液学毒性和缺乏细胞类型特异性的限制 [21], [22], [23], [24], [25], [26]。这些局限性在很大程度上源于CD47在正常细胞上的普遍表达，这突出了全身性CD47阻断的根本局限，并强调了需要巨噬细胞内在调节策略的必要性。因此，选择性调节巨噬细胞内SIRPα信号传导可能为恢复抗肿瘤免疫提供一种更安全、更精确的方法。鉴于其丰富性和免疫调节功能，TAMs代表了PDAC中一个极具吸引力但又充满挑战的治疗靶标 [27], [28], [29]。各种策略已被探索用于调节TAM功能并减轻免疫抑制性TME [30]。旨在清除TAM的方法，如集落刺激因子1受体（CSF-1R）抑制，可以减少巨噬细胞浸润，然而，它们也可能破坏正常组织中巨噬细胞的稳态 [31]。另一种选择是重编程策略，包括CD40激动剂和磷脂酰肌醇3-激酶γ（PI3Kγ）抑制剂，这些方法试图将巨噬细胞重新极化为促炎性表型，但这些方法通常缺乏细胞类型特异性，并可能诱导全身免疫效应 [32], [33]。总之，这些局限性凸显了在体内实现精确、持久且优先性巨噬细胞重编程的难度。DNA结合抑制因子3（ID3）最近已成为巨噬细胞身份和功能的关键调节因子 [34]。越来越多的证据表明，ID3通过部分抑制SIRPα来增强巨噬细胞介导的吞噬作用并促进促炎性表型 [34]。然而，TAMs中ID3缺失的功能后果可能不仅仅局限于解除SIRPα的抑制。例如，ID3已被证明能够拮抗免疫抑制性巨噬细胞编程并维持巨噬细胞中的促炎性细胞因子产生。这些通路并不能通过单纯的SIRPα阻断而直接重新激活 [34]。事实上，靶向CD47-SIRPα轴的治疗策略主要只是缓解"不要吃我"信号，但并不能内在地将TAMs重新编程为促吞噬和促炎状态。因此，在TAMs中恢复ID3表达可能实现双重效果。它既能缓解抑制性检查点信号，又能积极恢复允许吞噬和免疫激活的转录程序。这种综合获益不太可能仅通过靶向SIRPα的干预来实现。在此背景下，ID3恢复代表了一种概念上截然不同且可能更优越的策略，用以克服巨噬细胞介导的免疫抑制并重新激发抗肿瘤免疫。为此，利用基于mRNA的技术递送ID3在调节TAM功能方面具有几个独特优势。与病毒载体 [34] 或基因编辑策略不同，mRNA能够实现瞬时且可控的蛋白表达，而无基因组整合风险，从而最大限度地降低插入突变的潜在可能 [35]。此外，mRNA平台支持快速且可扩展的制造，这对于个性化治疗或联合疗法具有特别的优势 [36]。重要的是，mRNA递送特别适用于免疫细胞重编程，因为它允许动态且可逆地调节基因表达，同时不会损害细胞活力或固有功能 [37], [38]。然而，mRNA疗法的主要瓶颈在于缺乏高效且具有细胞特异性的递送系统 [39]。脂质纳米颗粒（LNPs）已成为一种经临床验证的体内mRNA递送平台 [40], [41], [42], [43]。与病毒或细胞方法相比，LNP-mRNA系统具有多种优势，包括可扩展的制造、无基因组整合风险的瞬时胞质表达，以及通过灵活的表面功能化实现靶向递送的能力 [44]。重要的是，甘露糖修饰促进了CD206阳性TAM的优先摄取，从而实现了巨噬细胞的原位重编程，同时保留了其组织驻留特性 [45]。在本研究中，我们旨在开发一种ID3 mRNA递送策略来重编程TAMs并重塑PDAC中的免疫抑制性TME（方案1）。我们构建了封装ID3 mRNA的甘露糖修饰脂质纳米颗粒（MLNP-ID3），以增强巨噬细胞靶向性。我们证明MLNP-ID3能有效下调SIRPα表达，增强巨噬细胞吞噬活性，并在原位Kras^LSL-G12D/+; Trp53^LSL-R172H/+; Pdx-1-Cre（KPC）衍生小鼠模型中抑制肿瘤进展。此外，MLNP-ID3促进促炎性免疫激活并增加瘤内CD8⁺ T细胞浸润。值得注意的是，MLNP-ID3与抗PD-1抗体（αPD-1）疗法联合使用时展现出增强的抗肿瘤协同效果，同时在该测试方案下显示出短期耐受性。总之，这些发现为通过mRNA递送实现精确的巨噬细胞重编程提供了一种潜在策略，为PDAC的治疗提供了新的见解。**噬菌体增强型LNP-ID3的制备、表征及体外验证**为建立和验证基于ID3 mRNA的巨噬细胞重编程递送平台，通过体外转录（IVT）使用线性化质粒模板合成了mRNA（图S1），其序列信息列于表S2，随后通过微流控混合系统将其封装入脂质纳米颗粒（LNP-ID3）中。LNP制剂由可电离脂质SM102、DSPC、胆固醇和PEG脂质以50:10:38.5:1.5的摩尔比组成，与……一致**讨论**在本研究中，我们建立了一种基于甘露糖修饰脂质纳米颗粒（MLNP）的mRNA递送策略，通过原位ID3表达重编程TAMs用于胰腺癌免疫治疗。巨噬细胞是胰腺肿瘤中最丰富的免疫细胞群体之一，在维持免疫抑制性TME中发挥着核心作用 [28], [29], [57]。先前的研究表明，巨噬细胞治疗策略，包括过继性巨噬细胞转移和体外遗传……**结论**我们的研究表明，通过LNP递送ID3 mRNA能有效重编程TAMs，增强抗肿瘤免疫并抑制胰腺肿瘤进展。从机制上看，MLNP-ID3介导的TAM重编程破坏了CD47-SIRPα天然免疫检查点并促进促炎性肿瘤微环境，从而改善了PD-1阻断的疗效。总之，这些发现确立了ID3介导的TAM重编程作为一种有前景的巨噬细胞靶向mRNA……**材料**DMG-PEG_2k（货号 O02005）和SM102（货号 O02010）购自AVT Pharma Technology Co., Ltd.（中国上海）。DSPE-PEG_2k（货号 SN-M-LP06）、胆固醇（货号 SN-M-CL26）和DSPC（货号 SN-M-L77）购自SunLipo NanoTech（中国）。DSPE-PEG_2k-甘露糖（货号 YS-D1823）购自重庆裕斯医药科技有限公司（中国）。T7高产RNA转录试剂盒（N1-甲基假尿苷）（货号 DD4202）购自Vazyme（中国）。CAP1 GAG（货号）……**作者贡献**X.L.、W.Z.和H.W.构思并设计了研究框架。W.Z.、H.W.、J.Z.、Q.H.、K.D.、E.W.、H.Y.、X.S.和J.Z.进行了实验并进行了数据分析。X.L.、W.Z.、H.W.、Y.L.和J.J.进行了数据解读和讨论。X.L.、W.Z.、H.W.和Y.L.起草和撰写了手稿。所有作者都仔细阅读了最终手稿并批准其发表。**CRediT作者贡献声明****周文静：** 写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，监督，方法学，概念化。**王浩阳：** 写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，验证，监督，方法学，形式分析，数据整理，概念化。**李宇婷：** 写作 – 审阅与编辑，写作 – 原稿，方法学。**赵骏：** 验证，调查。**黄强：** 验证，方法学，调查，数据整理。**邓凯：** 概念化。**王耳丽：****利益冲突声明**作者已为本工作的部分方面提交了专利申请（中国专利号 CN202511808600.5）。作者声明无其他利益冲突。**致谢**本工作由国家自然科学基金（32471438）、浙江省自然科学基金（LDQ24B020002）、浙江省"尖兵""领雁"研发攻关计划（2025C01109 和 2024SDYXS0001）资助，并得到浙江肿瘤医院、杭州医学院和中国科学院的启动基金支持。作者感谢杭州医学院共享仪器核心设施的设备使用。周文静|王浩阳|李宇婷|赵骏|黄强|邓凯|王耳丽|杨红红|时夏昱|张家|蒋金红|刘相升