二维蒙特卡洛模拟预测巴氏杀菌奶中原料奶细菌群落的存活与后续生长

《Journal of Dairy Science》：A 2-D Monte Carlo simulation to predict the pasteurization survival and subsequent growth of the bulk tank raw milk bacterial community in high-temperature, short-time pasteurized milk

　　

： 通常认为HTST巴氏杀菌可杀死牛奶中除耐热菌（thermodurics）和细菌芽孢（bacterial spores）以外的大部分细菌。然而，HTST巴氏杀菌的开发旨在实现原料奶中最耐热病原菌（即伯氏柯克斯体Coxiella burnetii）的5个对数（5-log） reduction，而非针对腐败微生物的削减。即使单个存活的耐冷菌（psychrotolerant）细胞也可能生长并导致腐败。在本研究中，研究人员建立了HTST巴氏杀菌削减及后续原料奶储罐（bulk tank raw milk, BTRM）细菌群落生长的模型。为考虑输入参数中的不确定性，研究人员将模型设计为二维蒙特卡洛模拟（2-dimensional Monte Carlo simulation）。利用现有原料奶需氧平板计数（aerobic plate count, APC）数据拟合BTRM微生物负荷的正态分布，并通过文献数据及专家咨询确定原料奶中20个最常见且相关的细菌分类群及其相对丰度。专家咨询还用于估算各属在HTST巴氏杀菌过程中的对数削减量（log reduction）。在运输和储存条件下的后续生长利用既往生长实验数据或文献推断进行建模。基线模型模拟美国东北部供应链，预测货架期第21天时，中位5%的容器显示细菌浓度达到100万cells/mL的证据，第5百分位为0%，第95百分位为21%的容器腐败。与历史货架期数据验证表明，该模型能够准确预测BTRM细菌群落的净对数削减量及巴氏杀菌后容器中的细菌浓度。然而，模拟的货架期第14天和第21天中位腐败比例（即0%、12%）与观察比例（即5%、29%）存在偏差，表明该模型应主要用于情景的相对比较而非绝对预测。敏感性分析显示，预测的腐败容器比例受类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的相对丰度及对数削减量、BTRM细菌浓度以及多个供应链环节的时间/温度条件强烈影响。不同假设情景评估表明，通过大幅降低巴氏杀菌前的微生物负荷及严格控制供应链温度，可减少BTRM细菌群落成员导致的微生物腐败。此外，模型预测0.87%的半加仑容器在巴氏杀菌后至少含有1个热敏感耐冷微生物细胞，模拟显示其在货架期第7天有5%的发生率、第21天有50%的发生率生长至超过腐败阈值，表明即使在巴氏杀菌后，这些微生物仍存在有意义的残余腐败风险。本研究开发的模型提供了一个从农场到餐桌（farm-to-table）的框架，用于评估BTRM细菌在HTST巴氏杀菌液态奶中的潜在腐败影响，并可用于整个供应链的数据驱动决策。

论文解读

一、研究背景与问题

原料奶储罐（bulk tank raw milk, BTRM）含有多种细菌分类群，这些细菌在HTST巴氏杀菌（即至少72°C保持15秒）后的液态奶中具有不同的腐败潜力。影响某一细菌分类群在巴氏杀菌后腐败潜力的重要特征包括：其在原料奶储罐中的初始浓度、耐受HTST巴氏杀菌的能力（即耐热性）以及低温生长能力（即耐冷性）。芽孢形成菌的内生芽孢具有耐热性，即使在HTST时间-温度组合处理后通常也仅表现出最小削减。BTRM中发现的芽孢形成菌包括芽孢杆菌属（Bacillus）和类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的物种。虽然耐热性不如芽孢形成菌，但耐热菌（thermoduric bacteria）也可能因巴氏杀菌而仅表现出有限的削减。BTRM中发现的耐热菌包括棒状杆菌属（Corynebacterium）、肠球菌属（Enterococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、链球菌属（Streptococcus）和微杆菌属（Microbacterium）的物种。此外，BTRM还含有热敏感菌属，预计HTST巴氏杀菌可将其削减超过5个log10 cfu/mL，包括假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter）。

进入巴氏杀菌后供应链的细菌种群由BTRM细菌种群的组成和耐热性决定。因此，BTRM细菌群落的组成和耐热性是预测HTST巴氏杀菌奶中细菌生长的核心参数。已有研究利用模拟模型评估巴氏杀菌奶中的细菌生长，但这些模型均假设每个牛奶容器由单一菌株达到微生物阈值（如1,000,000 cfu/mL）。Su等（2025）报告其模型低估了因耐冷芽孢形成菌而腐败的容器比例，并推测这种差异可能归因于仅假设每个容器污染1个分类群的假设。现有模型通常还假设腐败菌污染通过两种途径发生：巴氏杀菌前耐冷芽孢形成菌污染和巴氏杀菌后革兰氏阴性菌污染（post-pasteurization contamination, PPC）。然而，HTST巴氏杀菌是旨在控制牛奶中病原体存在的安全措施，具体为实现病原菌伯氏柯克斯体5个对数的削减，而非控制腐败微生物。因此，这一假设造成了空白，因为它排除了BTRM中存在的非芽孢形成菌（即耐热菌和热敏感菌）可能以低水平存活于HTST巴氏杀菌并随后生长导致腐败的可能性。例如，如果巴氏杀菌前热敏感腐败菌的浓度为3 log10 cfu/mL，在10个对数削减的情况下，大约每5,000个1,900 mL（半加仑）容器中会有1个含有1个存活细胞；在5个对数削减的情况下，每5个半加仑容器中会有1个。因此，在细菌生长预测模型中纳入存活热敏感微生物的残余腐败风险是必要的，这将有助于合理设计原料奶质量改进策略。

一个有望解决这些空白的数据来源是利用非培养依赖方法（如16S rRNA基因扩增子测序和鸟枪测序）对BTRM微生物群落的表征。到目前为止，非培养依赖分析已用于描述BTRM中的微生物群落、比较BTRM与巴氏杀菌奶的微生物群落以及调查与培养依赖牛奶质量指标的关联。然而，据研究人员所知，非培养依赖微生物群落数据尚未被用于模拟模型来预测牛奶中的细菌生长。在其他研究领域，非培养依赖微生物群落数据已被应用于定量微生物风险评估，其优势在于涵盖广泛的生物体及其相互作用和时空模式。认识到非培养依赖微生物群落数据在全面建模细菌群落及其在牛奶中生长的潜力，研究人员将这些数据作为本模型的基础。

二、研究内容与结论

为弥补现有模型忽略BTRM细菌群落中非芽孢形成菌巴氏杀菌后生长潜力的空白，研究人员创建了一个全面的从农场到餐桌建模工具，以二维蒙特卡洛模拟（2-dimensional Monte Carlo simulation）的形式量化BTRM细菌群落在HTST巴氏杀菌奶中的生长潜力，并利用非培养依赖微生物群落数据。将模型设置为二维蒙特卡洛模拟，可以区分模型输出中由变异性引起的变异与由不确定性引起的变异。量化预测不确定性对于向具有不同风险耐受性和管理目标的奶牛养殖者和加工商传达风险至关重要，从而支持透明、基于风险的决策，并确定未来潜在研究的领域。

三、关键技术方法

研究人员首先基于3篇综述文献和3位专家咨询确定了BTRM中20个最常见和/或最相关的细菌分类群，并根据Rodrigues等（2017）报道的相对丰度将每个分类群归入4个相对丰度类别之一。通过专家咨询确定各分类群在HTST巴氏杀菌过程中的对数削减量分布，定义了4个耐热性类别（即“极耐热”、“耐热”、“热敏感”、“极热敏感”），每个类别对应三角分布。根据Trm?i?等（2015）的生长分类（6°C下21天后log10 cfu/mL的增加量），定义了4个生长行为类别（即“不生长”、“少量生长”、“中等生长”、“高生长”），并基于文献为每个分类群分配生长类别比例。模型模拟了4个子过程：初始化BTRM中不同细菌浓度和种群组成、HTST巴氏杀菌过程中的热灭活、分配到半加仑容器以及后续在供应链各环节时间/温度条件下的生长。模型对2,000个生产批次（每个批次从1个BTRM及其相关微生物群落开始）进行迭代，每个批次模拟100个半加仑容器，货架期为40天（部分假设情景为55天）。BTRM总细菌浓度（N_{bulk tank}）的均值和标准差通过拟合纽约州100个农场在1年内6次采样的log10转换需氧平板计数（APC）数据的正态分布获得。供应链各环节的时间和温度条件分布与Qian等（2023）和Su等（2025）使用的相同。不确定参数包括各分类群的相对丰度（遵循狄利克雷分布Dirichlet distribution）和HTST巴氏杀菌对数削减量（遵循三角分布）；可变参数包括生长参数和供应链时间/温度条件。

四、研究结果

（一）基线模型预测

基线模型模拟美国东北部供应链，预测货架期第21天时，中位5%的容器显示细菌浓度达到100万cells/mL的证据，第5百分位为0%，第95百分位为21%的容器腐败。与历史货架期数据验证表明，该模型能够准确预测BTRM细菌群落的净对数削减量及巴氏杀菌后容器中的细菌浓度。然而，模拟的货架期第14天和第21天中位腐败比例（即0%、12%）与观察比例（即5%、29%）存在偏差，表明该模型应主要用于情景的相对比较而非绝对预测。

（二）敏感性分析

敏感性分析显示，预测的腐败容器比例受类芽孢杆菌属（Paenibacillus）的相对丰度及对数削减量、BTRM细菌浓度以及多个供应链环节的时间/温度条件强烈影响。

（三）假设情景评估

不同假设情景评估表明，通过大幅降低巴氏杀菌前的微生物负荷及严格控制供应链温度，可减少BTRM细菌群落成员导致的微生物腐败。

（四）热敏感微生物残余风险

模型预测0.87%的半加仑容器在巴氏杀菌后至少含有1个热敏感耐冷微生物细胞，模拟显示其在货架期第7天有5%的发生率、第21天有50%的发生率生长至超过腐败阈值，表明即使在巴氏杀菌后，这些微生物仍存在有意义的残余腐败风险。

五、讨论与结论

该模型是首个在巴氏杀菌后细菌生长模拟中纳入热敏感分类群存活情况的模型。研究为乳制品生产商和加工商提供了一个实用、数据驱动的工具，以改善牛奶质量、延长货架期、减少腐败造成的经济损失，并评估原料奶微生物质量目标溢价的价值的工具。该模型提供了一个从农场到餐桌的框架，用于评估BTRM细菌在HTST巴氏杀菌液态奶中的潜在腐败影响，并可用于整个供应链的数据驱动决策。