加州奶牛致病性Leptospira物种与血清型特征：培养、lipL32 rtPCR与AmpSeq揭示新基因型及混合感染

《Journal of Dairy Science》：Bovine leptospirosis: Pathogenic species and serovars of Leptospira associated with dairy cows

钩端螺旋体病（leptospirosis）是一种具有重要经济意义的人畜共患细菌感染，可感染家畜，引起流产、死胎、不孕和产奶量损失。牛钩端螺旋体病呈全球分布，由Leptospira属致病性细菌感染引起；这些细菌可定植于雄性和雌性动物的肾脏或生殖道，并通过尿液、生殖道排菌或经垂直传播给胎儿来维持疾病传播。牛是L. borgpetersenii serovar Hardjo的储存宿主，但也可排出与牛感染和人畜共患传播相关的其他致病性物种和血清型（serovar）。在该观察性研究中，从加利福尼亚州一家屠宰场的奶牛采集尿液样本（n = 384），以检测致病性Leptospira的存在。总计56份尿液样本（15%）为阳性，其中55份（14%）经lipL32实时PCR（rtPCR）检测为阳性，24份（6%）经培养为阳性。对培养分离株进行特征鉴定，鉴定出L. borgpetersenii serovar Hardjo（n = 18）、L. interrogans serovar Pomona（n = 5）和L. interrogans serovar Copenhageni（n = 1）。对32份lipL32 PCR阳性但培养阴性的尿液样本进行Leptospira靶向扩增子测序（AmpSeq）分析，鉴定出23份为L. borgpetersenii阳性，1份为包含L. borgpetersenii和L. santarosai的混合感染阳性，4份为L. santarosai阳性；4份仍未明确。系统发育分析（phylogenetics）鉴定出L. borgpetersenii的一个新基因型，该基因型难以用当前培养基配方培养。鉴定当前在牛中循环的Leptospira物种和血清型对于有效的监测、诊断和预防策略至关重要。

研究背景：钩端螺旋体病（leptospirosis）为全球性人畜共患被忽视疾病，影响人、家畜、伴侣动物和野生动物；病原为Leptospira属螺旋体，目前含43个致病种和250余个血清型（serovar）。牛钩端螺旋体病通常呈亚临床，除非常年轻动物可出现急性病，或性成熟泌乳/妊娠雌性出现流产、不孕等不良生殖事件。主要病原为L. borgpetersenii serovar Hardjo，可在牛肾和生殖道定植并持续存在。既往美国5000余份牛肾调查培养阳性率为1.7%，以serovar Hardjo、Pomona和Grippotyphosa为主。问题在于Leptospira培养要求苛刻、世代时间长，传统培养基限制于29°C；新HAN培养基可在37°C从原宿主样本回收Leptospira。分子诊断常用致病性Leptospira特异基因lipL32实时PCR（rtPCR），高通量测序（HTS）和AmpSeq可在无培养条件下解析物种与基因型；菌素疫苗（bacterin vaccines）缺乏异源交叉保护，因此需明确牛群循环血清型。该观察性研究据此开展，以鉴定屠宰奶牛相关Leptospira物种和血清型。研究总体发现，加州奶牛尿样中致病性Leptospira排菌率较高，存在Hardjo、Pomona、Copenhageni、L. santarosai及混合感染，并发现一个难以培养的L. borgpetersenii新基因型；这对监测、诊断和疫苗策略具有意义。

关键技术方法（≤250字）：样本队列来自2023年2月至9月美国南加州一家牛肉加工厂，对象为>3岁成熟雌性荷斯坦奶牛，于屠宰后经膀胱穿刺采集尿液384份。研究人员采用HAN培养基在37°C、5% CO₂下培养；以lipL32 rtPCR检测致病性Leptospira；对培养株进行Illumina全基因组测序（WGS）、显微镜凝集试验（MAT）血清群/血清型鉴定及基于单核苷酸多态性（SNP）的系统发育分析；对PCR阳性培养阴性尿样进行AmpSeq（42个引物组、13个基因及29个SNP丰富位点）；并以蛋白/脂多糖（LPS）电泳与免疫印迹、仓鼠腹腔接种10⁸条Leptospira评估毒力。

结果：
Detection of pathogenic Leptospira in urine by lipL32 rtPCR and culture（尿液中致病性Leptospira的lipL32 rtPCR与培养检测）：通过384份尿样检测，55份（14.32%）lipL32 rtPCR阳性，平均Ct为33.68 ± 4.71；6份显示内标对照（IPC）抑制；24份（6.25%）培养阳性；1份培养阳性而rtPCR阴性，提示PCR抑制。结论为rtPCR与培养互补。
Molecular and serotyping of Leptospira isolates（Leptospira分离株的分子与血清学分型）：通过24株培养分离株WGS，18株（75%）为L. borgpetersenii，6株（25%）为L. interrogans；18株L. borgpetersenii均属血清群Sejroe；L. interrogans中5株属Pomona血清群、1株属Icterohemorrhagiae血清群；单克隆抗体分型确定CA-110为serovar Hardjo，CA-90、CA-104、CA-120为serovar Pomona，CA-103为serovar Copenhageni。结论为Hardjo为主，并存在Pomona和Copenhageni。
AmpSeq-based molecular typing of pathogenic Leptospira in lipL32 rtPCR-positive but culture-negative urine（lipL32 rtPCR阳性但培养阴性尿样的AmpSeq分子分型）：通过32份培养阴性PCR阳性尿样AmpSeq，28份成功定型；23份为L. borgpetersenii，CA-137为L. borgpetersenii与L. santarosai混合感染，4份为L. santarosai，4份未定型；12份高覆盖样本的系统发育分析与WGS高度一致，并与牛源BU-16及肯塔基样本KY_3、KY_8聚为同一新分支，具100%自举支持。结论为培养阴性样本中存在L. borgpetersenii新基因型、L. santarosai及混合感染。
Proteins and lipopolysaccharide（蛋白与脂多糖）：通过代表性菌株电泳和免疫印迹，Pomona、Copenhageni和Hardjo菌株蛋白谱相似，均表达LipL32、LipL41和LipL21；LPS谱在血清型间差异明显，参考抗血清确认Copenhageni、Pomona和Hardjo的O-抗原（O-antigen）特异性。结论为血清型相关LPS差异与免疫印迹分型一致。
Evaluation of infectivity（感染性评估）：通过仓鼠腹腔接种10⁸条Leptospira，Copenhageni CA-103引起严重急性病，4 d时全部安乐死，肝、肾培养和lipL32 rtPCR均阳性；Pomona CA-90、CA-104、CA-120及Hardjo CA-110、CA-271无急性症状，3周时肾培养和rtPCR阳性、肝阴性。结论为Copenhageni牛分离株高毒力，Pomona和Hardjo呈亚临床肾定植。

讨论部分总结：新培养基与HTS分子方法推进了牛钩端螺旋体病流行病学认识。该研究培养阳性率>6%，高于1991年美国牛肾调查的1.7%，原文认为可能反映培养基改进及尿样代表整个肾脏；仅部分肾脏用于培养可致假阴性。分离株仍以serovar Hardjo为主、其次Pomona，未分离Grippotyphosa但意外分离Copenhageni；Copenhageni与人间急性钩端螺旋体病相关，鼠为经典储存宿主，牛尿中此前亦有分离报道。>14%奶牛排菌，且1份PCR阴性培养阳性强调IPC识别假阴性的重要性。AmpSeq适用于培养阴性样本；培养阴性样本形成与培养阳性样本分开的L. borgpetersenii新分支，并包括BU-16、KY_3、KY_8等牛源样本；新西兰Pacifica样菌亦难以培养。混合感染L. borgpetersenii与L. santarosai得到分子证据，L. santarosai主要见于中美和南美且遗传多样。研究限制为单一设施、8个月尿样且未检测血清；结论需要更广地理范围研究以评估奶牛群钩端螺旋体病水平、确定疫苗血清型、L. santarosai真实范围及新基因型流行率和意义。

研究结论（译）：研究结果确认，超过14%的受检奶牛正通过尿液主动排出多种物种和血清型的存活致病性Leptospira；这证明有必要开展更多地理范围广泛的附加研究，以评估奶牛群钩端螺旋体病水平。这对于识别应纳入有效牛用菌素疫苗（bacterin vaccines）的血清型、确定L. santarosai在奶牛中的真实范围，以及确定尚未鉴定或表征的L. borgpetersenii新基因型的流行率和意义至关重要。