整合蛋白质组、N-糖基化蛋白质组与磷酸化蛋白质组揭示山羊初乳至成熟乳乳脂球膜蛋白的动态重塑及磷酸化驱动机制

《Journal of Dairy Science》：Proteomic, N-glycoproteomic, and phosphoproteomic profiling reveals dynamic remodeling of goat milk fat globule membrane proteins across lactational stages

　　

山羊乳脂球膜（milk fat globule membrane, MFGM）蛋白对新生后代的早期发育、免疫调节和代谢稳态至关重要。然而，山羊初乳（goat colostrum, GC）与成熟乳（mature milk, GM）中MFGM蛋白的组成及其N-糖基化和磷酸化的动态变化尚未阐明。为全面表征GC与GM之间MFGM蛋白的动态变化，本研究采用Astral数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和免标记定量N-糖基化蛋白质组学。共鉴定出3,129种蛋白质、67种N-糖基化蛋白和1,016种磷酸化蛋白。组间差异分析显示蛋白质水平无显著差异，仅鉴定出4个差异N-糖基化肽（FDR <0.05）。相比之下，磷酸化蛋白质组表现出显著变化，保留201个高置信度差异磷酸化蛋白。在GC阶段，高表达的MFGM蛋白及其修饰形式主要参与肠道免疫球蛋白A（immunoglobulin A, IgA）合成、补体和凝血级联，以及核黄素、色氨酸和维生素B₆的代谢途径。进一步的蛋白质-蛋白质相互作用分析鉴定了连接免疫、脂质代谢和物质运输的核心枢纽蛋白和关键功能模块。总之，研究人员的发现提示，山羊MFGM在早期泌乳期间的功能重塑可能主要由动态蛋白磷酸化驱动，而非蛋白丰度或N-糖基化占据本身的变化，并且该过程可能有助于新生儿被动免疫发育和消化功能改善。这些新见解为优化山羊早期饲养策略和开发代乳品提供了重要依据。

研究背景方面，山羊乳脂球膜（milk fat globule membrane, MFGM）蛋白仅占山羊乳总蛋白的1–4%，但对维持乳脂肪球物理稳定性、调节肠道菌群组成和强化肠黏膜屏障具有重要作用。MFGM蛋白可发生N-糖基化、磷酸化等修饰，其中N-糖基化影响蛋白折叠与稳定性、细胞黏附、信号转导和代谢，磷酸化可改变蛋白静电性质与三维结构并影响免疫调节和发育功能。现有研究已涉及乳源MFGM蛋白及其修饰，但山羊初乳（goat colostrum, GC）与成熟乳（mature milk, GM）之间MFGM蛋白N-糖基化和磷酸化的动态变化研究仍有限，且万林白山羊此前未见相关翻译后修饰系统研究。因此，研究人员首次采用Astral数据非依赖采集（data-independent acquisition, DIA）蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和免标记定量N-糖基化蛋白质组学，系统表征GC与GM中MFGM蛋白组成及翻译后修饰，并通过生物信息学解析差异蛋白、糖基化蛋白和磷酸化蛋白的生理功能、调控机制及互作网络，为优化羔羊早期营养、开发功能乳制品和筛选潜在营养与免疫生物标志物提供依据。

关键技术方法方面，样本来自安徽阜阳临泉县和丰畜牧场的健康万林白山羊12只，GC于产后1 d内采集，GM于产后1个月采集；按每4只山羊乳混合为1个生物学重复，每组3个生物学重复；实验经安徽农业大学动物护理与使用委员会批准（AHAUXMSQ2023036）。研究方法包括Astral-DIA蛋白质组学、Astral-DIA磷酸化蛋白质组学和免标记定量N-糖基化蛋白质组学，并结合主成分分析、基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集、STRING/Cytoscape蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络和MEME基序分析。

研究结果如下。Identification and Differential Analysis of MFGM Proteins in GC and GM：共鉴定3,129种MFGM蛋白，其中2,641种为GC与GM共享，189种为GC特有，299种为GM特有；按错误发现率（false discovery rate, FDR）<0.05未发现显著差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs），按P<0.05得到GC相对GM 95种上调、54种下调蛋白，上调蛋白主要位于细胞外，下调蛋白主要位于细胞核，Ig样结构域蛋白在GC中更高。GO and KEGG Pathway Enrichment Analysis of DEPs Between GC and GM：149种DEPs获得231个显著GO条目和219条KEGG通路，其中11条通路显著富集；上调蛋白富集于肠道IgA生产免疫网络、核黄素代谢、色氨酸代谢、补体和凝血级联及维生素B₆代谢，下调蛋白富集于黏着斑、基底细胞癌、铁死亡、ATP依赖染色质重塑、白细胞跨内皮迁移和剪接体，铁死亡相关DEPs最多。Identification of N-Glycoproteome in GC and GM：鉴定98个N-糖基化位点、82个N-糖基化肽和67个N-糖基化蛋白；GC中定量61个位点、54个肽和46个蛋白，GM中48个位点、44个肽和41个蛋白，共享39个位点、37个肽和35个蛋白；FDR筛选显示Ig mu chain C region在GC上调，A0A452DUI8、GLYCAM1和FGG下调；按P<0.05另发现SMB domain-containing protein和JCHAIN上调。Functional Annotation and Enrichment Analyses of MFGM N-glycoproteins：差异N-糖基化肽对应蛋白分布于8类功能，细胞组分主要富集于细胞外空间和细胞表面，生物学过程富集于血小板活化、纤溶和凝血，分子功能富集于蛋白-大分子适配器活性；下调蛋白独特富集于细胞黏附分子通路。Analysis of Phosphorylation Patterns of the MFGM Protein in GC and GM：磷酸化位点主成分析显示组间差异明显；Ser占83.45%、Thr占14.77%、Tyr占1.78%；共鉴定3,049个磷酸肽和1,016个磷酸化蛋白，GC特有417个磷酸肽和66个磷酸化蛋白，GM特有590个肽和97个蛋白；约47.83%的MFGM磷酸化蛋白含2个及以上位点，SRRM2最多含89个位点；FDR筛选得GC相对GM 163个磷酸肽上调、177个下调，映射为117个蛋白上调、87个蛋白下调，3个蛋白兼具上调和下调磷酸肽；RAB11FIP1、SLC38A10、MLF1和TJP2各有单一位点上调，SRRM2和SRRM1分别有40和29个位点下调，13个蛋白兼具上调和下调修饰肽。Analysis of Phosphorylation Motifs in MFGM Proteins of GC and GM：上调磷酸肽含R-X-X-S*基序，-3位精氨酸保守，为PKA和AKT/PKB等激酶识别特征；下调磷酸肽含S*-P基序，+1位脯氨酸保守，为MAPK家族或细胞周期蛋白依赖性激酶识别特征。GO and KEGG Pathway Enrichment Analysis of Differentially Phosphorylated MFGM proteins in GC and GM：340个差异磷酸肽对应蛋白获得68个功能条目，细胞组分富集于剪接体复合物和免疫球蛋白复合物，生物学过程富集于IL-4细胞反应、翻译起始调控、维生素D反应和内皮肠道屏障建立，分子功能富集于eIF4E结合和RNA结合；上调蛋白富集于mTOR信号通路、蛋白输出和PI3K-Akt信号通路，下调蛋白富集于剪接体和核质运输。Analysis of the PPI Network of DEPs and Their N-glycosylation and Phosphorylation Between GC and GM：GLYCAM1为N-糖蛋白组与磷酸化蛋白组唯一共同蛋白；鉴定136个独特DEPs、187个独特磷酸化蛋白及13个二者共有蛋白；四种算法前10枢纽蛋白中CTNNB1、FBL、HSP90AB1、LMNA、PPIG和SRRM2一致出现，CTNNB1为DEPs网络中心节点，HSP90AB1连接DEPs与磷酸化蛋白；MCODE识别3个主要模块，分别关联RNA剪接与mRNA加工、凝血/纤溶/急性期反应、RNA加工与翻译起始耦合；RNA剪接模块中SRSF1、SRSF2、SRSF7和SRSF9为磷酸化蛋白，RBM8A桥接DEPs与磷酸化蛋白；凝血模块中FGG为N-糖基化中心节点，AHSG和SPP1连接循环DEPs；翻译模块中EIF4G1、EIF4B和EIF5强互作，SRRM1连接度高，RBM8A维持桥接作用。

讨论部分总结：作者围绕免疫球蛋白在GC与GM中的积累、能量代谢相关蛋白富集、物质运输相关蛋白富集及PPI互作展开。N-糖基化上调涉及Ig mu chain C region、SMB domain-containing protein和JCHAIN，JCHAIN可稳定IgA/IgM多聚体并增强黏膜免疫；聚合免疫球蛋白受体（polymeric immunoglobulin receptor, pIgR）在GC上调并富集于肠道IgA生产网络。紧密连接蛋白β-catenin和coagulation protein-1分别在GM和GC高表达；ZO-1/ZO-2多个位点磷酸化在GC上调，作者提出其可能作为血乳屏障通透性的分子开关。能量代谢方面，线粒体三功能酶α亚基、载脂蛋白A-IV和bridge-like lipid transfer protein family member 2在GC上调，GLYCAM1兼具N-糖基化和磷酸化，脂肪酸合酶4个位点磷酸化在GC上调，提示利于脂质分泌和新生羔羊脂质利用。物质运输方面，EIF4EBP1含最多磷酸化位点，T10位点磷酸化在GC上调；GOLPH3在GC上调，参与反式高尔基体网络（trans-golgi network, TGN）囊泡运输和MFGM蛋白分泌。PPI分析提示核心枢纽整合磷酸化信号与转录调控，FGG、SPP1和AHSG兼具N-糖基化和磷酸化，RBM8A参与RNA剪接模块调控。局限性在于每个生物学重复由4只山羊乳混合，可能压缩组内方差并高估DEPs/位点数量，研究采用FDR<0.05控制稳健性；核心枢纽由多肽一致磷酸化模式支持；未来需个体水平大样本和靶向蛋白质组学或抗体方法验证。

研究结论部分翻译：总之，对GC与GM山羊MFGM的多组学分析揭示了翻译后重塑事件统计支持度的清晰层级。动态蛋白磷酸化成为早期泌乳期间MFGM功能转变最稳健和明确的驱动因素，鉴定出340个FDR显著差异磷酸肽。相反，全蛋白丰度经FDR校正后无统计学显著变化，而N-糖基化仅产生4个显著差异N-糖基化肽，名义P<0.05阈值下检测到的糖基化位点仅提供温和调控变化的暂定提示，需独立验证。生物信息学富集分析将全部改变的MFGM蛋白与新生儿免疫、肠道稳态和代谢适应联系起来，PPI分析预测CTNNB1为核心网络枢纽。总体而言，研究人员的充分支持性结论强调，磷酸化动态是重塑MFGM从GC到GM生物活性的主导机制，为靶向开发山羊功能乳制品和优化羔羊代乳品奠定基础。