开放DVP：面向社区驱动深度视觉蛋白质组学的实验与计算框架

《Nature Methods》：OpenDVP: an experimental and computational framework for community-empowered deep visual proteomics

深度视觉蛋白质组学（Deep Visual Proteomics，DVP）是一种用于细胞类型特异性和空间分辨蛋白质组学的新兴方法。然而，其广泛应用一直受到缺乏社区驱动生态系统内开源端到端工作流的限制。为此，研究人员提出了 openDVP，一个可达且可扩展的 DVP 实验与计算框架。openDVP 将开源图像分析工具（MCMICRO、QuPath 和 napari）与 scverse 格式（AnnData 和 SpatialData）结合，用于多组学整合。该框架提供两条工作流：一条是不需要图像分析专业知识的快速通道流程，另一条是融合图像预处理、分割和空间分析前沿方法的人工智能驱动流程。研究人员将 openDVP 应用于三项档案组织研究（人胎盘、早期肺腺癌和局部复发三阴性乳腺癌），把空间单细胞表型与探索性蛋白质组测量相整合。最后，研究人员提出细胞邻域（Cellular Neighborhood，CN）深度蛋白质组分析作为一种可扩展的空间发现蛋白质组学方法。

研究背景方面，空间蛋白质组学在灵敏度、通量和空间分辨率上快速发展，但传统靶向抗体方法通常只能检测约60种蛋白，难以覆盖单类细胞可能表达的超过10,000种蛋白的蛋白质组。将靶向成像与超灵敏液相色谱（Liquid Chromatography，LC）-质谱（Mass Spectrometry，MS）结合的 DVP 能实现探索性、空间分辨的蛋白质组分析；不过既有 DVP 方案依赖专有软件，缺少非专有、开源、可扩展、支持图像分析、激光显微切割（Laser Microdissection，LMD）实验设计、多模态整合和跨平台互操作的工作流，限制了系统基准测试、可扩展性与社区创新。因此，研究人员开发 openDVP，作为模块化开源框架，既服务计算经验有限的使用者，也支持复杂空间分析。

主要关键技术方法方面，研究人员使用人胎盘首次妊娠早期流产标本、单例早期肺腺癌（LUAD）连续切片中经空间转录组（Spatial Transcriptomics，ST）表征的标本，以及三阴性乳腺癌（Triple-Negative Breast Cancer，TNBC）初发与化疗后局部复发配对档案组织；图像上依托 MCMICRO 与 SOPA 做预处理和分割，napari 做交互质控与门控表型，QuPath 做注释，QuPath-to-LMD 将注释转为 LMD 轮廓；蛋白质组上采用超低输入组织蛋白质组流程、label-free dia-PASEF 与 DIA-NN 分析；数据整合采用 AnnData 与 SpatialData，并在 scverse 生态下用 scanpy、scimap、spatialproteomics 做表型、细胞邻域与分析。

研究结果部分，概述 openDVP 框架：研究人员构建开源模块化框架，提供 flashDVP 快速通道与 AI 驱动扩展流程，支持全切片（Whole-Slide Image，WSI）、组织微阵列（Tissue Microarray，TMA）、H&E、免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）与多重 IF（multiplexed IF，mIF），并实现图像、单细胞矩阵、轮廓导出与 LMD 的衔接。高效可扩展图像处理：基于 MCMICRO 与 SOPA，支持 Cellpose、Mesmer、InstanSeg 等分割模型；11 张 WSI 共634万细胞分割不到2小时，体现兼容性与可扩展性。支持多样空间蛋白质组实验：框架不依赖专有格式，采用 Bio-Formats 兼容的 OME-TIFF，适用于宽场或共聚焦显微镜场景。交互式质控与标记阈值单细胞表型：napari-cell-gater 插件以类流式密度图做阈值反馈，生成标记截断值汇总表，形成过滤后单细胞矩阵以指导 LMD。图像分析与 LMD 的通用接口：QuPath-to-LMD 支持 Leica LMD7 与 MMI CellCut，把组织学注释转为 LMD 就绪轮廓并验证对齐。通过 scverse 整合图像与 MS 蛋白质组：用 AnnData 与 SpatialData 把图像表型层和 LC–MS 定量层叠加，兼容 scanpy、scimap、spatialproteomics。openDVP 量化人胎盘细胞类型分辨蛋白质组：flashDVP 对合体滋养层（Syncytiotrophoblast，STB）、细胞滋养层（Cytotrophoblast，CTB）与 Hofbauer 细胞（HBC）做手动注释和 LMD，鉴定3,994种唯一蛋白；主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）按细胞类型分离，差异蛋白与公开转录组一致，STB 富集类固醇激素代谢、囊泡运输和能量代谢，CTB 与 HBC 富集 RhoJ GTPase 和 VEGF 信号，HBC 富集免疫调节与 mRNA 剪接，细胞通讯分析显示 CTB 与 STB 间黏附、细胞外基质和 ESAM 自分泌信号活跃。openDVP 耦合空间转录组揭示微环境药物靶点：研究人员以 CosMx 空间转录组定义上皮-间质转化（Epithelial-to-Mesenchymal，EMT）微环境，对 EMT niche 肿瘤细胞做 IF 与 LMD 蛋白质组，鉴定约5,956种蛋白；EMT niche 肿瘤细胞内皮-间质表型明确，NDRG1 与 LGALS1 蛋白上调，GLUT1（由 SLC2A1 编码）最上调，糖酵解、缺氧、血管生成与 EMT 通路增强；在483例 LUAD 与347例正常队列及人类蛋白质组图谱中验证 SLC2A1/GLUT1 高表达，且高表达预后更差，说明微环境引导多组学可发现 niche 特异性药物靶点。openDVP 揭示原发与复发 TNBC 肿瘤微环境重塑：九标记 mIF 全切片分析原发与复发 TNBC，分割61万与100万细胞，鉴定肿瘤、T 细胞、B 细胞、巨噬细胞与基质细胞；复发样本 B 细胞与 CD8⁺ T 细胞减少，CD68⁺ 巨噬细胞约16倍增加，VIM⁺ 基质约4倍扩张；scimap 的 spatialLDA 鉴定7个 CN（CN0–CN6），原发以淋巴细胞围管/导管原位癌（Ductal Carcinoma In Situ，DCIS）为主，复发转为巨噬细胞内侵润微环境。cnDVP 提升蛋白质组覆盖与通量：常规 DVP 每孔切100个单细轮廓，scDVP 收单细但小免疫细胞常蛋白数过低，cnDVP 用单个轮廓包裹100个同表型细胞，采集快约100倍；cnDVP 肿瘤与免疫 niche 平均比 DVP 多26%蛋白鉴定，膜蛋白略富集，而不同方法间组织与 niche 定量高度相关。cnDVP 解析空间肿瘤异质性与复发程序：CN 引导 LMD 取 CN0 肿瘤特异、CN5 肿瘤-免疫界面、CN6 免疫富集区，203个高质量蛋白质组显示 CN 特异性强；原发肿瘤特异 CN 异质性更高、空间自相关更强，复发样本克隆选择后多样性下降；免疫 CN 上调干扰素（Interferon，IFN）-γ、补体与血红素代谢，肿瘤 CN 转向糖酵解、EMT、MYC 与 IFN 信号，复发组织广泛 IFN-high 肿瘤表型，对应炎症型 TNBC 与免疫逃逸。

讨论部分总结：研究人员强调 openDVP 不是单一 DVP 实现，而是围绕开源工具与 scverse 的可演化框架；flashDVP 降低门槛，扩展流程支持大规模图像与 CN 级采样；cnDVP 在通量、组织回收和 QC 上优于细胞池化 DVP，但生物分辨率低于 DVP/scDVP，更适合同源或空间连贯 niche；所有流程都受组织质量、染色、成像、分割、LMD 效率影响。未来可结合更高重成像、病理基础模型与更高灵敏度 MS 拓展空间蛋白质组。

研究结论部分翻译：在此，研究人员提出 openDVP 这一基于 Python 的开源框架，使 DVP 具有广泛可及性、互操作性和社区驱动性。openDVP 围绕成熟开源工具与 scverse 生态，将图像处理、细胞表型、空间分析、LMD 与 MS 蛋白质组纳入模块化工作流，并使用标准数据格式促进已有与新开发工具的整合，支撑可发现、可访问、可互操作、可重用数据原则。openDVP 的核心概念是并非每个生物学问题都需要相同水平的图像分析或空间分辨率；flashDVP 提供标注-收集-测量的低门槛入口，图像引导蛋白质组采样可补充其他空间组学，并把难以分割的结构纳入探索性蛋白质组。扩展流程支持从预定义细胞类型走向空间多细胞结构，cnDVP 通过收集空间连贯细胞群而非单个分割轮廓，降低 LMD 复杂度同时保留空间与表型信息，并提供 DVP 与 scDVP 之间的中间尺度。openDVP 应被视为模块化框架而非固定流程，其最优实现取决于生物学问题与实验背景。展望未来，更高重成像、病理基础模型与 MS 灵敏度提升将进一步提高空间采样分辨率和通量。总之，openDVP 为跨生物尺度的空间发现蛋白质组学提供了开放可扩展框架，并通过互补采样策略与可互操作图像/蛋白质组数据架构，降低 DVP 技术壁垒，同时保留高级空间分析所需灵活性。