MRPL40经CREB-MSX1信号轴调控神经嵴细胞迁移与心脏流出道隔化

《Journal of Biological Chemistry》：MRPL40 Regulates Cardiac Outflow Tract Septation by Modulating Neural Crest Cell Migration via CREB-MSX1 Signaling

　　

22q11.2缺失综合征（22q11.2DS）导致多系统疾病，其中心脏缺损最为突出，典型表现为圆锥动脉干畸形。在22q11.2缺失区域内，若干基因已被鉴定为心脏发育的关键调控因子；然而，该区间大多数基因的功能仍知之甚少。在此，研究人员研究了Mrpl40，其编码线粒体核糖体蛋白L40（MRPL40），以确定其在心脏形态发生中的功能。在神经嵴细胞（NCCs）中缺失Mrpl40导致圆锥动脉干缺陷。具体而言，Mrpl40缺陷损害NCC迁移，导致流出道（OFT）隔化延迟和旋转异常。机制上，研究人员发现Mrpl40缺失破坏CREB磷酸化，导致Msx1表达降低，而Msx1是NCC迁移和分化的关键调控因子。总之，该研究证明线粒体在NCC行为中的关键功能，并明确Mrpl40在OFT发育中的重要作用，为理解22q11.2DS的病因提供新见解。

研究背景：22q11.2缺失综合征（22q11.2DS）是人类常见染色体微缺失综合征，由22号染色体长臂约50个基因单倍剂量不足引起，先天性心脏病（CHD）常见且多为圆锥动脉干畸形。虽Tbx1、Crkl及Slc25a1等被鉴定为心脏发育调控基因，但该缺失区间多数基因功能不清，限制对CHD发病机制及防治策略的理解。神经嵴细胞（NCCs）经上皮-间质转化（EMT）脱离神经管并迁移分化，其中心脏神经嵴细胞（CNCCs）参与流出道（OFT）隔化；CNCC发育异常导致永存动脉干、右室双出口（DORV）和室间隔缺损（VSD）等。Mrpl40位于22q11.2缺失区，编码线粒体核糖体大亚基组分，既往研究提示其单倍剂量不足导致小鼠线粒体钙调节异常及精神分裂症样表型，但其在NCC发育和CHD中的作用不明。鉴于线粒体参与细胞命运决定，研究人员假设线粒体功能影响OFT发育，并通过NCC迁移分化研究Mrpl40。该研究在NCC中条件敲除Mrpl40，发现OFT隔化缺陷及圆锥动脉干畸形，机制为ATP减少降低CREB磷酸化，下调Msx1，损害NCC迁移分化，减少OFT心胶质垫中NCC来源间充质细胞。研究将Mrpl40确定为NCC发育关键调控因子，并提出NCC线粒体功能障碍是22q11.2DS相关CHD潜在机制。

关键技术方法：研究人员采用Wnt1-Cre; Mrpl40^f/f小鼠在NCC谱系条件敲除Mrpl40，并以Rosa26-mTmG进行谱系追踪；胚胎OFT组织来源于小鼠模型，公共NCC单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据来自GEO数据库GSE210521。方法包括苏木精-伊红（H&E）与免疫荧光（IF）、TUNEL与PHH3检测、RNAscope、RNA测序（RNA-seq）、Western blot、透射电镜（TEM）、原代NCC分离及siRNA/过表达/药物处理（H-89、PFT-α、Dox、8-Br-cAMP）、ATP与cAMP检测和划痕实验。

研究结果：
Deletion of Mrpl40 in neural crest leads to OFT defects：scRNA-seq显示Mrpl40在NCC广泛表达；Wnt1-Cre; Mrpl40^f/f在E11.5 OFT中经qRT-PCR和Western blot证实敲除；突变胚胎可存活至围产期但P1死亡；E18.5全部出现DORV、主动脉骑跨、VSD等圆锥动脉干缺陷。
Mrpl40-deficiency results in delayed OFT septation：E12.5对照OFT远端主动脉/肺动脉分隔清晰，突变体无分隔，CNCC两柱排列紊乱；E13.5突变体远端出现隔膜，E15.5主动脉/肺动脉已分开但位置异常，DORV/VSD确认，提示隔化延迟。
Loss of Mrpl40 causes failed CNCC organization at E12.5：谱系追踪显示E12.5对照GFP⁺ CNCC形成主动脉肺动脉隔，突变体缺失，远端OFT未分隔；α-SMA减少且隔桥心肌化缺失；Plexin A2与Sema3c表达降低；SOX9⁺GFP⁺/GFP⁺减少，提示CNCC来源间充质细胞减少。
Mrpl40-deletion NCCs show a defect in migration into the OFT from E10.5：E9.5 SOX10、AP-2α标记迁移NCC比例无差异；E10.5突变体GFP⁺ NCC来源细胞减少，PHH3增殖无差异，TUNEL凋亡增加，AP-2α⁺GFP⁺/GFP⁺降低，迁移入OFT减少。
Altered expression pattern in Mrpl40-deletion NCCs：OFT RNA-seq显示凋亡信号和ER应激上调，线粒体呼吸链复合物组装、间充质细胞分化/命运决定和细胞迁移下调；Dlx4、Alx1、Alx3、Alx4、Pax3、Mab21l2、Msx1等NCC迁移分化相关基因下调。
Mrpl40 deficiency impairs mitoribosomal stability and respiratory chain function：TEM显示突变NCC线粒体肿胀、嵴长度显著减少；原代NCC siMrpl40后线粒体形态异常；MRPL38、MRPL44、MRPS35降低；mtDNA编码CI-ND5、CIII-CYTB、CIV-MTCO2、CV-ATP6降低而nDNA编码蛋白无显著变化；OPA1降低、DRP1升高，PGC-1α和TFAM降低。
CREB functions as an upstream mediator of MSX1：siMrpl40 NCC ATP和cAMP降低；p-CREB⁺GFP⁺/GFP⁺减少而总CREB不变；MSX1⁺GFP⁺/GFP⁺降低；原代NCC中p-PKA C、p-CREB、MSX1降低；Prkaca沉默或H-89处理降低PKA Cα、p-PKA C、p-CREB和MSX1；MSX1过表达恢复Mrpl40沉默NCC划痕闭合率。
Reducing levels of p53 does not rescue the defects caused by Mrpl40 deficiency：突变OFT p53升高、NCC凋亡增加；PFT-α处理降低p53但不改变MRPL40和MSX1，也不恢复划痕闭合；孕鼠i.p. PFT-α后E10.5凋亡无显著差异，AP-2α和MSX1仍降低，提示p53不是唯一机制。
8-Br-cAMP administration partially rescues the defects caused by Mrpl40 silencing and pharmacological inhibition of mitoribosomal translation：8-Br-cAMP恢复siMrpl40 NCC的p-PKA C、p-CREB、MSX1；Dox抑制线粒体翻译导致mtDNA编码OXPHOS蛋白降低、线粒体形态异常，8-Br-cAMP部分恢复形态及p-PKA C、p-CREB、MSX1。

讨论部分总结：Mrpl40是OFT发育中NCC生物学关键调控因子，通过cAMP/PKA/CREB调控Msx1。NCC中Mrpl40缺失破坏线粒体核糖体稳定性，导致翻译缺陷和线粒体损伤，进而损害NCC迁移分化；E9.5时增殖、凋亡、迁移无显著差异，E10.5出现凋亡增加和迁移受损，故其关键作用在E9.5之后。p53通路虽上调，但PFT-α不能挽救OFT发育，提示p53介导凋亡非唯一机制，其他机制待鉴定。Mrpl40在NCC广泛表达，NCC依赖完整线粒体功能满足高能量需求，MRPL40调控线粒体核糖体活性，区别于主要参与转录调控和胞内运输的其他22q11.2基因。NCC特异性Mrpl40杂合缺失未致明显心脏结构缺陷，而完全缺失导致严重线粒体功能障碍、NCC迁移分化受损和OFT畸形；Meghan Wynne等报道Mrpl40-null胚胎致死、Mrpl40^+/-小鼠存活并轻度VSD，作者认为与NCC特异性完全敲除而非整体敲除有关。研究不排除22q11.2其他共缺失基因协同；斑马鱼mrpl40与prodha双突变表型加重提示多基因作用。Mrpl40缺陷胚胎E12.5 OFT隔化失败伴PlexinA2和Sema3c降低；作者提出Sema3c/PlexinA2信号改变可能破坏细胞间通讯。与Ankrd11和Nkx2.5增强子研究相似，OFT隔化与旋转相关，但Mrpl40影响旋转的具体机制需进一步研究。

研究结论翻译：总之，该研究阐明Mrpl40如何通过影响NCC迁移和分化调控OFT发育，并有助于增进对NCC发育和OFT发育中线粒体稳态的理解。