结直肠癌患者黏膜相关大肠埃希菌的致病岛与抗菌药物耐药性：与结直肠腺瘤及健康对照的比较

《Scientific Reports》：Antimicrobial resistance and pathogenicity islands in mucosa-associated Escherichia coli in colorectal cancer patients

　　

结直肠癌（CRC）是成人最常见的癌症之一。大肠埃希菌（Escherichia coli）可能通过其毒力因子和炎症通路促进CRC的发生与进展。E. coli易获得抗生素耐药性；然而，CRC患者黏膜相关E. coli的抗生素耐药性仍未明确。本研究旨在确定从CRC患者分离的黏膜相关E. coli中致病岛（PAI）和抗生素耐药性的流行率与分布，并与结直肠腺瘤（CRA）和健康对照组比较。这项横断面研究纳入63株黏膜相关E. coli，分离自21例CRC、7例CRA和35名健康对照者的结直肠活检组织。采用纸片扩散法进行抗生素敏感性试验。通过PCR检测PAI（pks、PAI I-IV⁵³⁶、PAI I-II^CFT073和PAI I、II^J96）及β-内酰胺酶基因（碳青霉烯酶基因、CTX-M基因）。在来自CRC、CRA和对照组的黏膜相关E. coli中，分别有90.5%、57%、68.5%检测到一种以上PAI。pks和PAI IV⁵³⁶是本研究分离株中最常见的PAI。pKs阳性E. coli分离株与pks阴性E. coli分离株之间的抗生素耐药性无显著差异。CRC患者黏膜相关E. coli对氨苄西林、头孢他啶、氨曲南、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和头孢吡肟的耐药性显著高于正常受试者。NDM和OXA48是所有研究组中检测到的最常见碳青霉烯酶基因。CTX-M基因在全部黏膜相关E. coli分离株中的检出率为41.3%。结直肠肿瘤和正常个体中黏膜相关E. coli均存在多种PAI和多重耐药的高流行率。与健康受试者相比，CRC患者黏膜相关E. coli中PAI IV⁵³⁶及对氨苄西林、头孢他啶、氨曲南、头孢呋辛、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和头孢吡肟的耐药性流行率显著更高。研究人员建议提高对抗生素耐药性的认识，采取监测、改善卫生等策略以防止抗生素耐药性传播，并进一步研究评估抗生素使用对CRC中结肠E. coli的影响。

研究背景方面，结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是成人最常见的癌症之一。E. coli可通过毒力因子和炎症通路参与CRC的发生与进展。E. coli易获得抗生素耐药性，但CRC患者黏膜相关E. coli的耐药情况尚未明确。致病岛（pathogenicity island，PAI）是可移动遗传元件，可同时传播多个毒力因子，导致细菌毒力表型显著改变，并参与微生物进化和致病。pks基因组岛通过产生colibactin发挥致癌作用；共生E. coli常携带与尿路致病性E. coli（uropathogenic E. coli，UPEC）相关的PAI，这些PAI携带黏附素、毒素、铁获取、血清抵抗和荚膜等多个毒力基因；PAI I-IV⁵³⁶、PAI II^CFT073和PAI II^J96在持续存在菌株中较短暂菌株更常见，部分结肠癌黏膜相关E. coli可共享携带毒力基因的UPEC PAI。抗生素耐药是近年严重威胁之一，抗生素在临床和动物生产中的密集使用与滥用增加肠道菌群耐药性，并选择携带毒力和耐药基因盒的E. coli；耐药基因可能通过促进微生物逃逸或抑制抗肿瘤免疫影响免疫微环境；超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBL）和碳青霉烯耐药肠杆菌目（carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE）在恶性肿瘤等免疫抑制患者中问题突出，胃肠道定植多重耐药（multidrug-resistant，MDR）肠杆菌目可成为耐药基因储库和感染来源。CRC是否与肠道菌群抗生素耐药相关尚不清楚；UPEC-PAI和耐药模式已在正常个体肠道E. coli中研究，但针对CRC的研究较少。研究人员先前发现，Phylogroup B2及毒力基因（colibactin（clb）和细胞毒性坏死因子）在结直肠肿瘤中较高，但与正常个体无显著差异；UPEC PAI可在B2株中积累。因此，本研究比较CRC、CRA和健康对照黏膜相关E. coli中PAI分布、抗生素耐药谱、碳青霉烯酶基因和CTX-M基因。

研究人员开展的横断面研究纳入63株黏膜相关E. coli，来源于21例CRC、7例CRA和35名健康对照者的结直肠活检；每名参与者仅纳入1株。结论显示，结直肠肿瘤和正常个体黏膜相关E. coli中多种PAI和多重耐药均呈高流行；CRC患者中PAI IV⁵³⁶及对氨苄西林、头孢他啶、氨曲南、头孢呋辛、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和头孢吡肟的耐药性显著高于健康受试者。该研究提示应关注抗生素耐药、监测和改善卫生，并进一步评估抗生素使用对CRC结肠E. coli的影响。

技术方法方面，样本来源于前期研究收集的81名参与者结直肠活检，纳入21例CRC、7例CRA和35名健康对照共63株黏膜相关E. coli，每名参与者仅1株；排除炎症性肠病、复杂性CRC和憩室病，结肠镜前15天未使用抗生素或益生菌。采用Kirby–Bauer纸片扩散法按CLSI 2020进行药敏试验，并按标准判定MDR和广泛耐药（extensively drug-resistant，XDR）；对头孢噻肟或头孢他啶耐药株用联合纸片法确证ESBL，对亚胺培南耐药株用改良碳青霉烯灭活法（modified carbapenem inactivation method，mCIM）检测碳青霉烯酶。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测PAI（两个多重PCR检测UPEC-PAI，clbB阳性判为pks阳性）及CTX-M、bla_IMP、bla_VIM、bla_OXA-48、bla_NDM、bla_KPC基因；采用SPSS进行卡方检验或Fisher精确检验。

研究结果如下。致病岛：在63株黏膜相关E. coli中，97%至少携带1种PAI；不同组合的多PAI在对照、CRC和CRA中分别占68.6%、90%和57%；pks和PAI IV⁵³⁶最常见；PAI IV⁵³⁶在CRC中显著更高（P=0.026），pks在三组间无显著差异；PAI III⁵³⁶、PAI I^J96、PAI II^J96和PAI II⁵³⁶未检出。该结论由PCR检测PAI并结合组间比较得出。抗菌药物耐药模式：CRC和CRA所有分离株均为MDR或XDR，对照中83%为MDR或XDR；CRC患者黏膜相关E. coli对氨苄西林、头孢他啶、氨曲南、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和头孢吡肟的耐药率显著高于正常受试者；pks阳性与pks阴性E. coli间抗生素耐药性无显著差异。该结论由纸片扩散药敏试验和组间比较得出。ESBL表型检测：黏膜相关E. coli中ESBL表型总阳性率为62%，对照、CRC和CRA分别有22、12和5株阳性；mCIM在对照、CRC和CRA分别有15、5和5株阳性。该结论由联合纸片法和mCIM表型检测得出。β-内酰胺酶基因分布：CTX-M基因在对照、CRC和CRA分别检出15、8和3株，占全部分离株的41.3%；bla_NDM在对照、CRC和CRA分别检出40%、23.8%和57%，bla_OXA-48分别检出32%、19%和28.6%；bla_IMP、bla_VIM和bla_KPC未检出。该结论由PCR基因检测得出。

讨论部分总结显示，97%的黏膜相关E. coli至少携带1种PAI，pks和PAI IV⁵³⁶占优；这与瑞典研究中超过半数肠道共生E. coli至少携带1种PAI标志物以及pks在婴儿肠道持续定植菌中最常见等结果具有可比性；其他研究显示73.4%—88%的共生E. coli携带PAI且以PAI IV⁵³⁶为主；CRC患者中30%—40%结肠活检E. coli携带多个UPEC PAI，这些PAI携带与尿路感染相关的多个毒力因子。非pks PAI在定植菌中的存在可能提示其参与定植，定植菌可无症状持续存在并成为肠外感染来源。本研究中pks在对照、CRC和CRA分别检出77%、85.7%和100%（P=0.3），与Simpoh等报道CRC患者pks阳性E. coli较对照高但无统计学显著性一致；另有两项研究显示CRC中pks显著高于正常人群。本研究中各组PAI（包括pks）高流行可能与B2系统发育群占比较高有关，B2在对照、CRC和CRA分别占31.4%、61.9%和42.9%，该系统发育群因毒力因子基因积累而更易持续存在于肠道菌群。pks阳性与pks阴性分离株抗生素敏感性表型无显著差异，与伊拉克一项研究一致；癌症患者中pks阳性与pks阴性K. pneumoniae除磺胺类外耐药无显著差异，而另一项研究显示pks阳性K. pneumoniae耐药性较低但其中存在高耐药株。该研究黏膜相关E. coli耐药性高，CRC和CRA全部分离株及83%健康对照分离株为MDR或XDR；CRC患者较正常人群对氨苄西林、头孢他啶、氨曲南、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和头孢吡肟耐药显著更高；既往伊朗、其他地区研究也报道CRC相关E. coli高耐药，而一项meta分析除喹诺酮类和四环素类外未发现CRC与抗生素耐药显著相关；高耐药可能反映不同国家受试者微生物组耐药差异，也不能排除不恰当抗生素使用，尤其本研究结肠镜前停用抗生素时间较短。CRC患者中超过半数黏膜相关E. coli为ESBL产生者，CTX-M在38%的这些分离株中检出；联合纸片法ESBL阳性而PCR未检出CTX-M，可能与TEM或SHV等其他ESBL基因或质粒介导AmpC过表达有关。碳青霉烯酶基因在28.6%的CRC黏膜相关E. coli中检出，bla_NDM最常见，其次为bla_OXA-48；不同国家报道的ESBL和碳青霉烯酶肠道携带率存在差异。抗生素耐药基因更常见于CRC相关物种，碳青霉烯酶产生菌肠道携带可能导致严重威胁生命的感染。研究局限包括：结肠镜前停用抗生素时间短；需分析碳青霉烯酶基因以外的耐药基因；测序可提高基因鉴定可信度；多个UPEC PAI与黏膜相关E. coli基因组之间的相互作用可能产生不同表达谱，尚需评估。结论翻译为：结直肠肿瘤和正常个体中黏膜相关E. coli均存在多种PAI和多重耐药的高流行率；与健康受试者相比，CRC患者黏膜相关E. coli中PAI IV⁵³⁶及对氨苄西林、头孢他啶、氨曲南、头孢呋辛、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑和头孢吡肟的耐药性流行率显著更高；建议提高对抗生素耐药性的认识，采取监测、改善卫生等策略以防止抗生素耐药性传播，并进一步研究评估抗生素使用对CRC中结肠E. coli的影响。