瓦努阿图2017至2019年间亚显微间日疟原虫流行率与种群碎片化研究

《Scientific Reports》：Prevalence and fragmented populations of submicroscopic Plasmodium vivax in Vanuatu from 2017 to 2019

　　

瓦努阿图自2000年代中期以来疟疾发病率显著下降，但多个岛屿仍存在传播热点。研究人员于2017至2019年间在七个岛屿的已知热点地区开展横断面调查。在6,943名参与者中，研究发现Epi岛（4.3%；95% CI 3.0–6.0%）、Malekula岛（4.8%；95% CI 4.0–5.7%）、Santo岛（6.5%；95% CI 5.3–7.7%）、Maewo岛（0.4%；95% CI 0.1–1.2%）和Vanua Lava岛（1.2%；95% CI 0.5–2.8%）存在 exclusively 亚显微间日疟原虫（Plasmodium vivax）感染的低流行率。回归分析显示，在2,407名≤12岁儿童中，间日疟原虫感染与年龄（OR = 1.07，p = 0.007）和脾肿大（OR = 5.36，p < 0.001）显著相关。对53个间日疟原虫样本的微卫星（microsatellite）基因分型显示，Epi岛的寄生虫杂合度（HE = 0.173）和单倍型多样性（h = 0.731）低于Malekula岛（HE = 0.638；h = 0.990）和Santo岛（HE = 0.751；h = 0.984）。Epi岛间日疟原虫有效种群规模（effective population size，Ne）估计值比Malekula岛和Santo岛低一个数量级。三个岛屿间存在显著的遗传分化（FST = 0.018–0.138，p < 0.01）和明显的种群结构。截至2019年，瓦努阿图岛屿层面的间日疟原虫种群已呈现碎片化证据。

一、研究背景与目的

瓦努阿图是位于西南太平洋、由60多个有人居住岛屿组成的群岛国家，地处疟疾传播的边缘地带。历史上，该国疟疾传播以低度至中度流行为主，间日疟原虫（Plasmodium vivax）和恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）均有分布，其中恶性疟原虫在11月至次年4月的雨季呈现更显著的发病高峰。Anopheles farauti s.s.是瓦努阿图唯一已知的疟疾传播媒介，主要分布于沿海地区，以咸淡水池塘如泻湖和红树林沼泽为主要孳生地。不同岛屿间按蚊种群存在显著结构，提示媒介扩散有限，人类流动是岛屿间疟原虫基因流的主要驱动因素。

自2004年起，瓦努阿图卫生部通过高覆盖率的长效杀虫蚊帐（LLIN）、广泛可及的显微镜或快速诊断检测（RDT）诊断以及青蒿素联合疗法（ACT）治疗，在全国范围内加强了疟疾控制。年寄生虫发病率（API）从2003年的每千人74.5例降至2015年的每千人1.6例，但此后进展放缓。伴随API下降，疟原虫种类构成从恶性疟原虫与间日疟原虫共优势转变为间日疟原虫优势。2015年恶性疟原虫占比已降至35.5%，自2022年起未再检测到恶性疟原虫病例。2008年，卫生部在南部Tafea省启动试点消除项目，2014年推出逐省推进策略，目标在2025至2028年实现全国疟疾零传播。Tafea省于2017年获得疟疾消除认证，Torba省则有望于2019年达到同样状态。

然而，间日疟原虫特异性RDT检测间日疟原虫乳酸脱氢酶（pLDH），其分析灵敏度和诊断性能低于基于富组氨酸蛋白2（HRP2）的恶性疟原虫特异性RDT。由于间日疟原虫裂殖子偏好网织红细胞，大部分寄生虫生物量可能存在于骨髓和脾脏中，外周循环中的低寄生虫密度阻碍了RDT和显微镜对间日疟原虫感染的检测，亚显微间日疟原虫感染在不同地理区域占感染的大多数，尤其是在传播强度相对较低的地区。疟疾控制的效果可体现为寄生虫遗传多样性和有效种群规模（N_e）的降低，这加剧了遗传漂变效应。鉴于瓦努阿图疟疾发病率下降及间日疟原虫优势化转变，本研究旨在确定已知热点地区的寄生虫流行率和亚显微疟原虫感染比例，并表征岛屿间寄生虫种群的遗传多样性。

二、主要技术方法

本研究采用横断面社区监测设计，于2017年7至8月、2018年及2019年6至7月在七个岛屿（Mota Lava、Vanua Lava、Gaua、Santo、Maewo、Malekula和Epi）开展调查，社区根据当地卫生机构近期确诊疟疾病例的先验知识进行选择。Santo和Malekula岛因地理面积和热点数量于2017和2018两年分别调查，每个社区仅采样一次。参与者采用便利抽样法招募。研究共纳入6,943名参与者。现场采集手指血样用于血红蛋白测定和疟原虫感染检测，厚薄血膜经吉姆萨染色后由经验丰富的镜检人员现场检查。同时采集两份各70μl血斑于Whatman ET31 Chr滤纸上。实验室采用线粒体细胞色素c氧化酶-3（cox3）基因巢式PCR检测疟原虫感染，通过三个核基因座（msp1F1、msp1F3和MS16）的巢式PCR扩增验证间日疟原虫核DNA质量，保留至少两个核基因座扩增成功的样本进行微卫星分析。十二个高多态性微卫星标记经半巢式PCR扩增后，在Applied Biosystems 3730xl DNA分析仪上分型，仅以最小峰阈值100相对荧光单位（rfu）的主等位基因进行分析。统计分析采用混合效应二项逻辑回归模型、Arlequin 3.5.2.2计算遗传多样性指数、LIAN 3.7评估连锁不平衡（LD）、STRUCTURE v2.3.4和主成分分析（PCA）检测种群结构，并以VarEff包估计有效种群规模的时序变化。

三、研究结果

人口学和临床特征：共招募6,943名参与者，女性和≤15岁年轻个体占多数。12岁及以下儿童总体脾肿率为7.2%（95% CI 6.3–8.3%），发热患病率为10.4%（95% CI 9.7–11.1%），贫血患病率为25.5%（95% CI 24.4–26.5%）。

疟原虫感染流行率：光学显微镜未检出任何疟原虫感染。通过PCR，除Gaua和Mota Lava外所有岛屿均检出间日疟原虫感染。间日疟原虫流行率从2019年Maewo岛的0.4%（95% CI 0.1–1.2%）到2017年Santo岛的9.3%（95% CI 7.5–11.4%）不等。

间日疟原虫感染与临床和人口学特征的关联：在四个岛屿的2,407名儿童中，间日疟原虫感染与固定效应年龄（OR = 1.06；95% CI 1.02–1.12；p = 0.007）和脾肿大（OR = 5.36；95% CI 3.51–8.18；p < 0.001）显著相关。随机效应岛屿的方差为0.67，组内相关系数（ICC）为0.18。

间日疟原虫遗传多样性：265个PCR阳性样本中，97个（36.6%）通过DNA质量检查，53个（54.6%）样本在七个标记（MS5、MS6、MS7、MS9、MS10、MS12和MS3.27）上完成全基因分型，包括Epi岛13个（2018年）、Malekula岛20个（2017和2018年）和Santo岛20个（2017和2018年）。Epi岛的间日疟原虫遗传多样性低于Malekula和Santo岛，表现为所有七个微卫星标记中最少的等位基因数（范围=1–3）和最低的无偏杂合度（H_E）（均值=0.172；范围=0–0.295）、最低的单倍型多样性（h = 0.731 ± 0.133）和最小的平均配对差异（1.21 ± 0.82）。Malekula（标准化关联指数I_A^S = 0.16；p < 0.001）和Santo（I_A^S = 0.28；p < 0.001）种群中观察到微卫星等位基因间显著的连锁不平衡。Malekula岛上间日疟原虫遗传距离与地理距离呈显著正相关（r = 0.37；p < 0.001），而Epi岛（r = -0.11；p = 0.760）和Santo岛（r = 0.16；p = 0.074）未观察到显著相关。

间日疟原虫种群间的遗传结构：配对F_ST遗传距离（范围=0.018–0.138）显示三个岛屿间日疟原虫种群间存在显著（p < 0.01）分化。贝叶斯种群结构推断揭示三个可能的遗传簇（K），不同岛屿种群间混合程度低。主成分分析同样揭示三个大致对应岛屿来源的聚类，第一主成分区分Epi岛与Malekula和Santo岛的间日疟原虫谱系，第二主成分区分后者岛屿上几乎所有谱系。第一和第二主成分分别解释总体方差的25.7%和11.1%。

有效种群规模估计：基于H_E的N_e估计值因岛屿和突变模型而异。Epi岛的N_e估计值最低（IAM 234,928 ± 21,410；SMM 259,378 ± 23,638），比Malekula和Santo岛低一个数量级。对过去N_e变化的建模表明，Epi岛间日疟原虫种群在过去500代（假设无性繁殖周期为两天，即1,000天）中持续扩张，最近100代（200天）扩张速率加快，期间平均N_e估计值几乎翻倍。

四、讨论与结论

瓦努阿图卫生部自2004年加强疟疾控制后，全国病例数从2003年的超过15,000例降至2014年的不足1,000例，2012年以来零疟疾死亡。本研究中所有间日疟原虫感染均为亚显微水平，且超过90%无发热症状。由于这些感染未被现场诊断手段检出，且大多数感染中存在具有传播能力的间日疟原虫配子体，它们可能构成当地传播的主要来源。潜伏感染的优势加上热带间日疟原虫常见的频繁复发表型，部分解释了瓦努阿图间日疟原虫与恶性疟原虫消除进展的差异。儿童脾肿率（3.5–11.8%）低于二三十年前同一岛屿的报告值（21.2–52.7%），进一步证实瓦努阿图疟疾负担的下降。

与1996至2002年间样本显示五个岛屿间广泛的基因流形成鲜明对比，本研究中三个岛屿的间日疟原虫种群存在显著遗传分化，表明随着持续控制努力导致寄生虫流行率下降，基因流更为有限。贝叶斯混合推断和PCA分析显示种群主要按岛屿来源划分，与岛屿间基因流减少一致。Malekula岛上遗传距离与地理距离的显著正相关提示寄生虫扩散受限和岛内局灶性传播。类似的控制后基因流减少和种群碎片化现象此前在邻近的所罗门群岛也有报道。

逐省推进全国疟疾消除策略面临的主要挑战是寄生虫再引入和已接近或实现消除的岛屿上传播恢复的威胁。Torba省在2018年4至5月Vanua Lava岛暴发间日疟原虫疫情后错过了2019年消除目标，病例调查确认来自Santo岛的感染移民为可能的疫情来源。2019年8月横断面调查在Vanua Lava岛检出六个亚显微间日疟原虫感染，表明尽管省级消除团队迅速响应开展反应性病例检测和治疗，寄生虫仍然持续存在。对其中两个样本与来自其他岛屿样本的比较分析显示，Vanua Lava与Santo的间日疟原虫存在中等程度的遗传亲和性，Malekula的寄生虫也可能对Vanua Lava疫情有贡献。

尽管传播减少，Malekula和Santo岛的间日疟原虫种群在本研究中仍保持遗传多样性，具有较大的h和平均配对差异。低传播环境下间日疟原虫遗传多样性的维持可能归因于休眠肝期裂殖子（hypnozoites）引起的复发、传播性配子体更早出现以及低密度和亚显性感染导致漏诊和传播延长等因素。与Malekula和Santo形成对比，Epi岛间日疟原虫多样性较低，尽管三个岛屿寄生虫流行率相当。Epi岛许多间日疟原虫谱系密切相关，N_e的时间变化建模显示该种群自2017年末以来快速扩张，与Shefa省API从2017年的0.18升至2018年的1.7相印证。

本研究存在若干局限性。样本采集自选定岛屿的已知热点地区，感染流行率和临床特征不能推广至整个岛屿。便利抽样导致样本以女性和12岁及以下儿童为主，流行病学发现仅适用于抽样人群。低寄生虫密度限制了所有间日疟原虫感染的表征和完整十二个微卫星标记的使用。线粒体cox3基因每寄生虫20至150个拷贝与核基因座单拷贝的差异解释了不同的PCR扩增成功率。Malekula和Santo岛因可基因分型样本数量少而将2017和2018两年样本合并为单一种群，可能高估了N_e。由于横断面设计，无法区分原发感染和复发感染。

持续的疟疾控制措施已将瓦努阿图多个岛屿已知热点地区的间日疟原虫流行率抑制到低水平。不同省份岛屿间间日疟原虫种群遗传分化和种群结构的证据支持在省级层面实施控制和消除活动的策略。然而，近年来除Tafea省外所有省份疟疾发病率的上升凸显了瓦努阿图对疫情复燃的高接受性和脆弱性。为恢复国家疟疾消除进展，需要在活跃传播热点加强干预，在已消除地区加强监测和及时病例调查与响应。