《Scientific Reports》：Urinary kisspeptin as a non-invasive reproductive biomarker in crossbred cattle and black Bengal does
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Kisspeptin是下丘脑-垂体-卵巢轴的上游调节因子，在家畜发情周期和妊娠中发挥关键作用。KISS1基因也称为“metastatin”基因，已成为家畜繁殖生理学中有前景的诊断生物标志物。本研究旨在探究牛和山羊发情周期及妊娠期间尿液/血浆Kisspeptin
Kisspeptin是下丘脑-垂体-卵巢轴的上游调节因子，在家畜发情周期和妊娠中发挥关键作用。KISS1基因也称为“metastatin”基因，已成为家畜繁殖生理学中有前景的诊断生物标志物。本研究旨在探究牛和山羊发情周期及妊娠期间尿液/血浆Kisspeptin及其肌酐归一化比值的动态变化。实验动物包括两组（发情周期组和妊娠组）。发情周期组由12头发情周期杂交牛和12只发情周期黑孟加拉母山羊组成；妊娠组由12头妊娠杂交牛和12只妊娠黑孟加拉母山羊组成。在发情周期第0、6、12和21天，从每个发情周期动物组采集清晨新鲜尿液和血液样本；在妊娠期，从每个妊娠动物组每两周采集一次，用于测定尿液和血浆Kisspeptin。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定尿液和血浆Kisspeptin，采用碱性苦味酸法测定尿液和血浆肌酐。采用双因素重复测量方差分析（two-way repeated-measures ANOVA）分析样本，随后进行回归分析和Student t检验，以评估非妊娠与妊娠动物之间的显著差异。进一步采用受试者工作特征曲线（ROC）分析评估尿液和血浆Kisspeptin及其肌酐归一化比值的诊断性能。所获得的结果显示，在杂交牛和黑孟加拉母山羊发情周期中，尿液Kisspeptin（UKP）水平与血浆Kisspeptin（PKP）呈定性相似趋势（r=0.99）。在两种动物的发情周期中，UKP最高浓度（2.45±0.21 ng/ml和2.44±0.08 ng/ml）记录于发情前期。血浆Kisspeptin/肌酐比值最高也见于第21天（14.49±0.91和16.22±1.53），而相应的尿液Kisspeptin/肌酐比值分别达到11.84±0.70和7.47±0.34（杂交牛和黑孟加拉母山羊）。在杂交牛中，血浆和尿液Kisspeptin浓度从妊娠早期至晚期显著升高（P<0.05）（4.28±0.19至33.40±0.78；2.01±0.10 ng/ml至23.01±0.54 ng/ml）；在黑孟加拉山羊中相应为（3.49±0.53至30.50±1.26 ng/mL；1.68±0.01至19.84±0.82 ng/mL）。在杂交牛和黑孟加拉山羊中，妊娠晚期PKP/PC比值（134.9±10.96；127.30±6.62）显著高于UKP/UC比值（71.94±10.63；68.4±6.70 ng/ml）（P<0.01）。该研究结果显示，在杂交牛和黑孟加拉母山羊等发情周期和妊娠家畜尿液中可检测到Kisspeptin，且其与肌酐的比值可作为预测排卵和妊娠的可靠诊断标志物。
准确检测排卵和早期妊娠对杂交牛和山羊等家畜繁殖效率及农场盈利至关重要，是人工授精、胚胎移植和激素处理等现代繁殖技术成功应用的基础。现有直肠触诊、行为观察、超声及生化和分子方法虽常用，但依赖技能和精确时机，反复处理动物可造成应激，因此需要可靠、无创的生物标志物。Kisspeptin（KISS1基因编码的神经肽，生殖轴上游调节因子）通过GPR54受体刺激促性腺激素释放激素（GnRH）及黄体生成素（LH）/卵泡刺激素（FSH）脉冲释放，调节排卵；KISS1基因编码145个氨基酸前肽，加工为kisspeptin-54、14、13和10等活性肽，kisspeptin-54又称metastin，可作用于卵巢/睾丸，牛卵巢和胎盘已证实KP-KiSS1R系统表达。牛血浆Kisspeptin随妊娠进展升高，人尿中也可检测Kisspeptin，但尿Kisspeptin能否用于家畜繁殖诊断尚待回答；尿液浓度受尿量和水合影响，需以相对恒定排泄的肌酐（creatinine，Cr）归一化。印度牛约占牲畜总数36%，繁殖问题造成损失，漏情导致21天延迟和成本；黑孟加拉山羊多产、适应性强，但需准确繁殖监测。因此，研究人员在印度ICAR–National Dairy Research Institute东部区域站（ERS）Kalyani农场，以杂交牛（Jersey × indigenous breed）和黑孟加拉母山羊为对象，研究尿液/血浆Kisspeptin及肌酐归一化比值在发情周期和妊娠中的动态，并评估其诊断准确性；结果显示尿Kisspeptin可检测，其与肌酐比值有潜力作为预测排卵和妊娠的无创标志物。
关键技术方法（≤250字）：样本来自印度ICAR–National Dairy Research Institute东部区域站（ERS）Kalyani农场健康杂交牛（Jersey × indigenous breed，3–6岁）和黑孟加拉母山羊（1–2岁）队列，初筛各24只/头，分为发情周期组（各12）和妊娠组（各12）。通过行为观察与B型超声确认发情及卵泡动态；通过经直肠/经腹超声确认妊娠，牛90天后辅以直肠触诊。采集清晨新鲜中段尿和颈静脉血，发情周期第0、6、12、21天采样，妊娠期每两周采样。用酶联免疫吸附试验（ELISA）测尿液/血浆Kisspeptin，碱性苦味酸法测肌酐，计算UKP/UC与PKP/PC，采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）、Student t检验及受试者工作特征曲线（ROC）分析。
结果小标题1：杂交牛发情周期中尿液和血浆Kisspeptin及其与肌酐比值的动态变化。通过第0、6、12、21天采样、ELISA和超声卵泡动态，双因素重复测量ANOVA显示Kisspeptin测量变量与周期日显著交互（P<0.0001），周期日和样本类型主效应显著（P<0.0001）；UKP与PKP高度相关（r=0.99，P<0.05）；UKP在发情当天显著高于发情后期和间情期（P<0.05），最高为第21天发情前期2.45±0.21 ng/ml；PKP发情日3.30±0.14，发情后期2.16±0.13，间情期2.04±0.06，第21天最高4.17±0.17 ng/ml；PKP/PC第21天最高14.49±0.91，UKP/UC为11.84±0.70，PKP/PC显著高于UKP/UC（P<0.01）；Tukey差异最大在间情期第12天和发情前期第21天（P<0.05）。
结果小标题2：黑孟加拉母山羊发情周期中Kisspeptin动态变化。通过同样采样和检测，ANOVA显示样本类型、周期日及交互显著（P<0.0001）；UKP和PKP在发情前期第21天最高（UKP 2.44±0.08 ng/ml；PKP 3.84±0.14 ng/ml），显著高于其他阶段（P<0.05）；UKP在发情后期1.20±0.06与间情期1.20±0.01无显著差异，PKP在发情后期1.71±0.13与间情期2.10±0.11相当；UKP与PKP r=0.97；UKP/UC与UKP r=0.93，PKP/PC与PKP r=0.99；比值与原始浓度同样在发情前期第21天升高（P<0.05），PKP/PC最高16.22±1.53，UKP/UC最高7.47±0.34。
结果小标题3：杂交牛妊娠期间尿液和血浆Kisspeptin及其与肌酐比值动态变化。通过妊娠期每两周至285天采样、超声/直肠触诊和ELISA，ANOVA显示样本类型与妊娠日显著交互（P<0.0001），主效应显著；妊娠牛PKP和UKP显著高于健康非妊娠牛（P<0.0001）；UKP和PKP从第0天至第270天显著升高（P<0.05），第270天UKP为第0天122倍、PKP为82倍；全妊娠PKP显著高于UKP；UKP与PKP r=0.98，与肌酐比值r=0.99；早中晚妊娠UKP、PKP及UKP/UC、PKP/PC显著升高（P<0.01），晚妊娠最高。ROC显示四标志物曲线下面积（AUC）=1.000（P=0.000032）；最佳截断值（cut-off）为PKP>1.735 ng/mL、UKP>0.6922 ng/mL、UKP/UC>3.995、PKP/PC>10.04；UKP、UKP/UC、PKP/PC敏感性和特异性均100%，PKP为83.3%/83.3%。
结果小标题4：黑孟加拉母山羊妊娠不同天数和阶段尿液/血浆Kisspeptin及肌酐比值动态变化。通过妊娠第15至150天每两周采样、超声和ELISA，ANOVA显示样本类型与妊娠日显著交互（P<0.0001），主效应显著；妊娠母山羊PKP和UKP显著高于非妊娠（P<0.05）；ROC显示PKP AUC=0.819（95%置信区间（95% CI）0.609–1.000，P=0.0079），UKP AUC=0.882（0.719–1.000，P=0.0015），cut-off分别>1.735和>1.380 ng/mL，敏感性/特异性83.3%/83.3%和75.0%/91.7%；UKP/UC和PKP/PC AUC=1.000（P=0.000032），cut-off>3.665和>6.445，均100%/100%。UKP和UKP/UC各时间点无显著差异（P>0.05），PKP与PKP/PC差异显著；妊娠期UKP最高在第150天，PKP最高在第135天；PKP/PC和UKP/UC在第135天最高（分别为134.57±2.1和66.15±3.84），PKP/PC显著高于UKP/UC，尤其晚妊娠（P<0.01）。
讨论总结：原文指出，这是首次展示杂交牛和黑孟加拉母山羊全发情周期UKP和UKP/UC动态，也是首次详述妊娠UKP并评估诊断。尿中可检测Kisspeptin，UKP、PKP及比值随周期变化且高度相关；比值可校正尿浓缩和昼夜分泌误差。结果与人类研究定性相似，排卵前峰值与排卵刺激一致；UKP低于PKP可能因肾脏滤过不完全或降解。第21天观察需考虑个体差异，需更密采样和超声。妊娠期PKP随妊娠升高，与Mondal et al.、Kumar等报道一致；Kisspeptin/KISS1R参与胚胎植入，胎盘滋养层是循环Kisspeptin主要来源；尿肌酐相对稳定，肌酐归一化可靠；本研究未发现妊娠各阶段肌酐排泄明显变化，与Albin & Clanton不同，但Erb. et al.和De Groot and Aafjes支持肌酐稳定；因胎盘来源，UKP可能释放相对恒定且无显著昼夜变化。局限为样本量较小、发情周期固定采样日，需更大群体验证和更频繁采样、超声及激素谱。
结论部分翻译：研究结果显示，尿液Kisspeptin（UKP）及尿液Kisspeptin/肌酐比值（UKP/UC）在杂交牛和黑孟加拉母山羊发情周期和妊娠中呈现明显的时间变化，并与血浆Kisspeptin（PKP）高度相似；这些发现支持其作为监测生殖状态的无创生物标志物的潜力。尽管本研究的诊断性能优良，但鉴于样本量相对较小，应谨慎解释；在将尿液Kisspeptin推荐为常规现场妊娠诊断标志物之前，需在更大、更多样化的跨品种动物群体中验证。本研究在发情周期采用固定采样日以标准化样本采集，未来研究应纳入更频繁的发情期采样、超声监测和激素谱分析，以进一步改进尿液和血浆Kisspeptin动态的连续表征，并加强其作为家畜发情周期监测和排卵预测无创生物标志物的应用潜力。尿液Kisspeptin及肌酐归一化比值的非侵入性突出其在家畜生殖监测中的潜在用途；需进一步评估现场条件下的性能、在繁殖障碍中的适用性，并开发易于在兽医诊所和农场使用的快速现场尿液诊断试剂盒（如侧向流检测），最终有助于精准畜牧、更好的繁殖管理和家畜及可能野生动物的动物福利改善。
