《Scientific Reports》：Integrated transcriptomics and network toxicology suggests core targets and potential mechanisms of aspartame-related breast carcinogenesis
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英文摘要翻译：阿斯巴甜（APM）是一种在全球广泛使用的低热量人工甜味剂。尽管其长期健康风险日益受到关注，但将APM暴露与乳腺癌联系起来的潜在分子靶点和通路在很大程度上仍未得到探索。在本研究中，研究人员整合了网络毒理学和转录组学，并结合多种计算方法（包括机器学习
英文摘要翻译：阿斯巴甜（APM）是一种在全球广泛使用的低热量人工甜味剂。尽管其长期健康风险日益受到关注，但将APM暴露与乳腺癌联系起来的潜在分子靶点和通路在很大程度上仍未得到探索。在本研究中，研究人员整合了网络毒理学和转录组学，并结合多种计算方法（包括机器学习、分子对接和临床验证），以预测性地优先筛选可能参与APM相关乳腺癌发生的候选靶点和通路。研究人员获取了226个APM靶点和1973个乳腺癌相关基因，从中提取出46个重叠的潜在靶点。功能富集分析显示，这些靶点主要富集于与细胞增殖和迁移相关的生物学过程，以及多条癌症相关信号通路，包括癌症中的转录失调、TNF和IL-17信号通路。通过使用多算法机器学习模型，研究人员进一步筛选出5个具有良好诊断性能和稳定预测能力的核心靶点。研究人员对核心靶点进行了SHAP分析，并对贡献最显著的基因进行了虚拟基因敲除。最后，TCGA数据集进一步证实了这些核心靶点在乳腺癌亚型与正常组织之间的差异表达。总体而言，这些计算结果提供了一份优先排序的分子候选列表，并为未来关于APM与乳腺癌的实验和机制研究提供了产生假说的基础。
论文解读
一、研究背景与问题
阿斯巴甜（APM）是全球最常用的人工甜味剂之一，自1981年获美国FDA批准以来，已被数百个国家和地区授权使用。其甜度约为蔗糖的180–200倍，而热量仅为蔗糖的约1/200，因此被广泛添加到碳酸饮料、甜点等食品中。监测数据显示，APM的平均每日暴露量约为4.2 mg/kg体重，高消费人群可达18.7 mg/kg，已接近可接受每日摄入量（ADI）上限。尽管APM长期以来被认为安全，但近年来对其潜在健康风险的担忧不断增加。已有研究提示APM可能通过激活副交感神经系统间接触发胰岛素释放，导致血管炎症并加重动脉粥样硬化；长期低剂量摄入可能损害心脏和认知功能。更重要的是，一项涉及102865名参与者的随访研究（平均随访7.8年）报告，每日摄入APM超过16.5 mg与乳腺癌风险增加22%相关（HR=1.22，95% CI: 1.01–1.48）。然而，另一项历时近30年的护士健康研究未发现APM摄入与乳腺癌风险之间的显著关联。目前关于APM与乳腺癌关联的流行病学证据不一致，且动物研究存在物种和剂量差异，难以外推至人类。此外，APM在乳腺癌中的分子靶点尚未被充分表征，国际癌症研究机构（IARC）将APM列为2B类“可能致癌物”，主要原因是证据不足。因此，亟需通过系统策略来识别APM相关乳腺癌发生的潜在靶点和机制。
二、研究内容与结论
针对APM-乳腺癌研究中因果推断薄弱、靶点不明确和证据不足等瓶颈，研究人员开发了转录组学与网络毒理学整合策略。该策略首先从ChEMBL、PharmMapper、PubChem和SwissTargetPrediction四个数据库获取APM靶点，经去重和标准化后共获得226个人类APM靶点。同时，利用GEO数据库中的GSE37751数据集（61例乳腺癌组织与47例正常组织），通过差异表达基因（DEGs）分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）筛选乳腺癌相关基因，取两者并集后得到1960个乳腺癌靶点。将APM靶点与乳腺癌靶点取交集，得到46个APM相关乳腺癌发生的潜在靶点。功能富集分析显示这些靶点富集于细胞增殖、迁移以及癌症相关信号通路（如TNF、IL-17、FoxO等）。进一步采用多算法机器学习框架构建117个二分类模型，通过Upset plot一致性分析和SHAP分析，最终筛选出5个核心靶点：KDR、ROCK2、MME、CFD和F10。这些核心靶点在训练集和两个独立测试集（GSE42568、GSE45827）中均表现出良好的诊断效能（AUC均大于0.8）。SHAP分析显示MME、CFD和ROCK2对模型贡献最大。由于MME贡献最显著，研究人员对其进行了虚拟基因敲除，发现敲除MME后DOCK1、NUMA1和REEP5等下游基因出现显著扰动，提示MME可能在转录调控网络中占据核心位置。最后，TCGA-BRCA队列验证显示，MME、CFD和F10在所有乳腺癌亚型中均显著下调，而ROCK2在所有亚型中显著上调，KDR在Luminal A、HER2富集和TNBC亚型中显著上调。
结论：该计算研究提供了APM相关乳腺癌发生的优先分子候选列表，并生成可检验的假说，为未来实验和机制研究奠定基础。但该研究仅为生物信息学相关分析，不能推断APM暴露与乳腺癌发生或进展之间的因果关系，仍需进一步的实验和人群研究验证。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：（1）多数据库靶点收集与标准化：从ChEMBL、PharmMapper、PubChem和SwissTargetPrediction中获取APM靶点，并以UniProt ID统一去重；（2）转录组差异表达分析和WGCNA：对GSE37751数据集进行DEGs鉴定（FDR<0.05，|FC|>1.5），并通过WGCNA筛选与乳腺癌表型相关的基因模块；（3）多算法机器学习框架：采用rpart、LASSO、glm、Enet、SVM、plsRglm、RF、GBM、Ridge等9种算法及其组合构建117个模型，以10折交叉验证优化参数，基于AUC等7项指标选择最优模型，并筛选在超过80%模型中被选中的基因作为核心靶点；（4）SHAP分析和虚拟基因敲除：使用XGBoost模型计算SHAP值解释核心靶点贡献，并利用scTenifoldKnk包对MME进行虚拟基因敲除，评估下游转录组扰动；（5）TCGA数据库临床验证：利用TCGA-BRCA队列（1071例乳腺癌组织和113例正常组织）分析核心基因在不同分子亚型中的差异表达。
四、研究结果分述
APM靶点的获取：通过四个数据库共获得226个APM靶点，其中ChEMBL 17个、PubChem 40个、SwissTargetPrediction 87个、PharmMapper 106个。这些靶点覆盖了多种蛋白质类型，为后续与乳腺癌靶点的交叉分析提供了基础。
乳腺癌靶点的筛选：在GSE37751数据集上，OPLS-DA分析显示乳腺癌与正常组织的转录谱明显分离（Q2=0.549）。差异分析共鉴定出1812个DEGs。WGCNA分析构建了加权共表达网络，鉴定出17个共表达模块，其中MEblue模块与乳腺癌相关性最高，从中提取660个表型相关基因。将DEGs与WGCNA基因取并集，共获得1960个乳腺癌靶点。
APM相关乳腺癌潜在靶点：将226个APM靶点与1960个乳腺癌靶点取交集，得到46个潜在靶点。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示IL6是连接度最高的枢纽蛋白。GO分析显示这些靶点富集于血压调节、血液循环、内分泌过程、质膜信号受体复合物、细胞外基质和蛋白水解活性等功能。KEGG分析显示其富集于癌症相关通路（如癌症通路、癌症转录失调、FoxO、TNF、IL-17信号通路）以及代谢和炎症通路（如AGE-RAGE、脂质/动脉粥样硬化、细胞衰老）。
核心靶点筛选：基于46个潜在靶点构建的117个机器学习模型中，“Enet[alpha=0.1]+glm”模型综合表现最优（平均AUC=0.8674，SD=0.1156，P<0.05）。按靶点在所有模型中的出现频率>80%筛选，得到5个核心基因：KDR、ROCK2、MME、CFD和F10。OPLS-DA显示这5个基因在训练集和两个测试集中均能有效区分乳腺癌与正常组织。ROC分析显示训练集AUC=0.9581，测试集1 AUC=0.9830，测试集2 AUC=0.9545。SHAP分析显示MME、CFD和ROCK2是贡献最大的三个核心靶点。
虚拟基因敲除与TCGA验证：虚拟敲除MME后，DOCK1出现最显著的扰动（倍数变化>1000），其次是REEP5和NUMA1。TCGA-BRCA队列验证结果显示：MME、CFD和F10在所有乳腺癌亚型中均显著下调（P<0.05），其中MME在Luminal B中下降最显著；ROCK2在所有亚型中显著上调，且在TNBC中表达最高；KDR在Luminal A、HER2富集和TNBC中显著上调，但在Luminal B中与正常组织无显著差异。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，该研究整合转录组学和网络毒理学，为APM与乳腺癌的关联提供了计算层面的分子证据。46个重叠靶点中超过一半来自预测数据库（PharmMapper和SwissTargetPrediction），因此需要通过额外过滤标准降低假阳性率。GO和KEGG富集结果提示这些靶点可能通过癌症相关信号通路和代谢炎症网络发挥作用。IL6作为枢纽蛋白虽提示炎症信号参与，但其普遍存在于多种癌症相关网络，需谨慎解读。在机器学习筛出的5个核心基因中，MME已被报道是致癌PI3K信号的下游效应因子，介导细胞衰老和促肿瘤分泌组；CFD通过脂肪细胞依赖机制促进乳腺癌细胞侵袭和转移；ROCK2通过TGF-β信号调节上皮-间质转化；KDR介导内皮细胞存活和生长；F10基因多态性与乳腺癌易感性相关。虚拟敲除结果提示MME可能通过调控细胞骨架动力学、有丝分裂保真度和代谢通路影响乳腺癌。该研究作为探索性筛选研究，样本量有限，结果属于相关性分析，不能替代实验验证；APM靶点均为计算预测而非实验确证；DEGs来自单一转录组数据集，可能未能完全代表乳腺癌的分子异质性；未考虑真实世界APM暴露水平和药代动力学特性。结论强调，该工作提供了优先分子候选和可检验假说，但不推断因果关系，未来需开展实验和人群研究加以验证。
